猴cathepsin H基因敲减MARC-145细胞系构建

发布时间：2023-09-17 06:28

　　组织蛋白酶H(Cathepsin H)是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族的重要成员,是木瓜蛋白酶样家族中唯一己知的单氨基肽酶,其表达水平在活化的免疫细胞中增加,与其他组织蛋白酶一样,在许多重要的细胞中发挥核心作用,例如降解细胞内蛋白质、活化溶酶体内其他蛋白酶、重塑细胞外基质和参与细胞凋亡等。目前,关于猴Cathepsin H基因是否影响伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的复制尚未见研究报道。为了建立稳定且高效抑制猴Cathepsin H基因表达的MARC-145细胞,我们利用小干扰RNA技术靶向Cathepsin H基因。我们还检测了敲减Cathepsin H对PRV病毒复制的影响。运用荧光显微镜观察、流式细胞仪、病毒滴度测定、荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等手段检测PRV在shCathepsin H MARC-145细胞中增殖。结果表明,随着PRV-GFP感染时间的延长,shCathepsin H细胞中GFP的荧光强度显著低于shControl细胞,表明敲减Cathepsin H抑制PRV复制。进一步用PRV-QXX感染shControl和shCathepsin H细胞...

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【学位级别】：硕士

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致谢
英文缩略表
摘要
1. 文献综述
    1.1 伪狂犬病(PR)
        1.1.1 伪狂犬病
        1.1.2 伪狂犬病毒(PRV)的生物学特性
        1.1.3 PRV感染与宿主天然免疫
    1.2 组织蛋白酶
        1.2.1 组织蛋白酶概述
        1.2.2 组织蛋白酶的分类及主要特性
        1.2.3 组织蛋白酶的结构和定位
        1.2.4 组织蛋白酶的生理学功能
        1.2.5 组织蛋自酶与病毒的复制
    1.3 组织蛋白酶 H(Cathepsin H)
        1.3.1 Cathepsin H概述
        1.3.2 Cathepsin H生物学功能
        1.3.3 Cathepsin H结构
        1.3.4 Cathepsin H与疾病的发展
    1.4 RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)
        1.4.1 RNAi概述
        1.4.2 RNAi的原理
        1.4.3 RNAi的特征
        1.4.4 RNAi的应用
    1.5 展望
2. 引言
3. 材料与方法
    3.1 材料
        3.1.1 细胞和病毒
        3.1.2 抗体
        3.1.3 细胞培养耗材
        3.1.4 感受态和质粒
        3.1.5 主要仪器设备
        3.1.6 主要试剂
        3.1.7 常规生化试剂的配制
    3.2 试验方法
        3.2.1 CaCl₂法制备E.coli Top10感受态细胞
        3.2.2 引物设计与合成
            3.2.2.1 shRNA引物设计与合成
            3.2.2.2 Q-PCR克隆引物设计与合成
        3.2.3 猴源Cathepsin H基因shRNA重组质粒的构建和鉴定
        3.2.4 质粒提取
        3.2.5 慢病毒包装及稳定敲减MARC-145细胞系构建
        3.2.6 RNA提取
        3.2.7 RNA反转录
        3.2.8 荧光实时定量PCR检测
        3.2.9 荧光观察
        3.2.10 流式细胞术
        3.2.11 PRV病毒滴度测定
        3.2.12 Western Blot检测
            3.2.12.1 蛋白的收取(60 mm dish)
            3.2.12.2 BCA蛋白含量测定
            3.2.12.3 SDS-PAGE胶电泳
            3.2.12.4 湿转法转膜(PVDF膜)
        3.2.13 统计学分析
4 结果与分析
    4.1 猴源cathepsin基因敲减MARC-145细胞系构建
    4.2 猴源cathepsin基因敲减对PRV-GFP复制的影响
    4.3 猴源cathepsin基因敲减对PRV-gE蛋白表达的影响
    4.4 猴源cathepsin H基因shRNA重组质粒构建及鉴定
    4.5 猴源cathepsin H基因敲减MARC-145细胞系敲减效率检测
    4.6 猴源cathepsin H基因敲减对PRV-GFP复制的影响
    4.7 猴源cathepsin H基因敲减对PRV-QXX滴度的影响
    4.8 猴源cathepsin H基因敲减对PRV基因gB、TK转录的影响
    4.9 猴源cathepsin H基因敲减对PRV-gE蛋白表达的影响
5 讨论与结论
    5.1 讨论
    5.2 结论
参考文献
英文摘要



本文编号：3847190