抑制肺鳞癌细胞FANCM和USP1基因对顺铂的增敏效应

发布时间：2017-05-21 22:13

  本文关键词：抑制肺鳞癌细胞FANCM和USP1基因对顺铂的增敏效应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:DNA损伤修复是肿瘤细胞对铂类药物耐药的重要机制,FA/BRCA通路在铂类药物所致细胞DNA损伤的修复中发挥了关键作用。本研究通过抑制人肺鳞癌细胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白USP1,观察FA/BRCA通路激活状态,探讨这些干预对化疗药物顺铂(DDP)敏感性的影响。方法:体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞,按照脂质体转染试剂盒说明书介绍的程序将特异性针对FANCM和USP1基因的si RNA(FANCM-si RNA和USP1-si RNA)分别和共转染于SK-MES-1细胞株。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定转染后FANCM和USP1蛋白表达以验证si RNA转染效率确保转染成功;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后SK-MES-1细胞经10μg/ml DDP处理24h后的早期凋亡率变化;CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定转染前后细胞经10μg/ml DDP处理24h和48h后的生存率;蛋白质印迹法检测转染前后细胞经不同浓度梯度DDP处理后FANCD2蛋白单泛素化水平,以及免疫荧光染色检测转染前后细胞核内FANCD2核聚小体的表达状态。结果:(1)SK-MES-1细胞分别经FANCM-siRNA和USP1-siRNA转染后,与空白对照组和阴性对照组比较,FANCM蛋白和USP1蛋白表达均明显降低(两者均P0.05),表明FANCM-si RNA转染和USP1-si RNA转染皆有效;(2)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP处理24h,流式细胞术检测结果显示细胞的早期凋亡率明显高于未转染的细胞。但转染USP1-si RNA的细胞早期凋亡率高于转染FANCM-si RNA的细胞。USP1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后的细胞早期凋亡率明显高于单转染FANCM-si RNA细胞的早期凋亡率(P0.05),而与单转染USP1-si RNA细胞的早期凋亡率比较无明显差异(P0.05)。(3)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP分别处理24h和48h,细胞生存率和半数抑制率(IC50)明显下降,与未转染组比较均有统计学意义(P0.05);转染USP1-si RNA细胞的生存率低于转染FANCM-si RNA的细胞(P0.05)。USP1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后经DDP处理24h和48h的细胞生存率和IC50明显低于单转染FANCM-si RNA细胞生存率(P0.05),而与单转染USP1-si RNA细胞生存率比较无明显差异(P0.05)。(4)肺鳞癌SK-MES-1细胞经FANCM-si RNA转染并经DDP处理后,以FANCD2-L/S比值所表示的FANCD2单泛素化水平下调,同时胞核内的FANCD2核聚小体表达降低,提示FA/BRCA通路上游基因FANCM沉默导致FANCD2单泛素化受抑制。转染USP1-si RNA后,DDP诱导的FANCD2单泛素化水平上调,核内FANCD2核聚小体表达增强,提示FANCD2去泛素化酶USP1被抑制后,造成单泛素化的FANCD2堆积。此外,双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,DDP诱导的细胞FANCD2单泛素化水平明显高于单转染FANCM-si RNA的细胞,但低于单转染USP1-si RNA的细胞,胞核内FANCD2核聚小体表达无明显改变,这一结果的机制如上所述。结论:沉默FANCM基因后通过抑制FA/BRCA通路FANCD2蛋白单泛素化,使得FA/BRCA通路下游蛋白不能被激活,从而无法对DDP诱导的DNA损伤实施修复;沉默USP1基因后可使FANCD2去泛素化受抑制,导致已泛素化的FANCD2在细胞内堆积,亦不能激活FA/BRCA通路下游蛋白。两者都可阻断FA/BRCA通路,抑制DNA损伤修复,导致SK-MES-1细胞对DDP的敏感性增高,值得注意的是沉默USP1基因后对DDP的增敏效应更为明显。
【关键词】：肺鳞癌细胞 FA/BRCA通路 顺铂 FANCM USP1 si RNA
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 绪论14-21
• 1.1 前言14-17
• 1.2 研究目的、方法、实验方案和意义17-21
• 1.2.1 研究目的17-18
• 1.2.2 研究主要内容和方法18-19
• 1.2.3 实验方案和路径19-20
• 1.2.4 研究意义20-21
• 第二章 蛋白印迹法验证转染效率，FANCM和USP1基因沉默对DDP诱导SK-MES-1 细胞凋亡率的影响21-34
• 2.1 实验对象与实验器材21-24
• 2.1.1 细胞株21
• 2.1.2 主要仪器21-22
• 2.1.3 常用试剂22-23
• 2.1.4 常用试剂制备方法23-24
• 2.2 实验方法与技术24-30
• 2.2.1 细胞复苏、培养、传代、计数24-25
• 2.2.2 蛋白印迹法检测SK-MES-1 细胞株FANCM和USP1沉默后蛋白的表达25-28
• 2.2.3 Annexin V/PI流式细胞术分别检测SK-MES-1 细胞株FANCM和USP1基因沉默，及两个基因共沉默后的细胞凋亡率28-29
• 2.2.4 统计学分析29-30
• 2.3 实验数据与结果30-33
• 2.3.1 沉默FANCM和USP1基因后SK-MES-1 细胞FANCM和USP1蛋白表达30-31
• 2.3.2 沉默FANCM和USP1基因及两个基因共沉默后SK-MES-1 细胞早期凋亡率的变化31-33
• 2.4 数据与结果分析33-34
• 第三章 FANCM和USP1基因沉默对DDP诱导的SK-MES-1 细胞生存率的影响34-41
• 3.1 实验对象与实验材料34-35
• 3.1.1 细胞株34
• 3.1.2 主要仪器34
• 3.1.3 常用试剂34-35
• 3.2 实验方法与技术35-37
• 3.2.1 处理实验细胞35-36
• 3.2.2 CCK-8 法测定SK-MES-1 细胞FANCM和USP1基因沉默，及两个基因共沉默后的细胞生存率36
• 3.2.3 统计学分析36-37
• 3.3 实验数据与结果37-40
• 3.3.1 分别沉默FANCM和USP1基因及两个基因共沉默前后顺铂抑制SK-MES-1 细胞生存率的变化37-39
• 3.3.2 分别沉默FANCM和USP1基因及两个基因共沉默后SK-MES-1 细胞株半数抑制浓度的变化39-40
• 3.4 数据与结果分析40-41
• 第四章 FANCM和USP1基因沉默对DDP诱导SK-MES-1 细胞FANCD2单泛素化和核聚小体表达的影响41-52
• 4.1 实验对象与实验材料41-42
• 4.1.1 细胞株41
• 4.1.2 主要仪器41
• 4.1.3 常用试剂41-42
• 4.1.4 常用试剂制备方法42
• 4.2 实验方法与技术42-47
• 4.2.1 蛋白质印记法检测SK-MES-1 细胞株FANCM和USP1基因沉默，及两个基因共沉默后FANCD2蛋白表达和单泛素化水平42-45
• 4.2.2 免疫荧光法观察SK-MES-1 细胞株FANCM和USP1基因沉默，及两个基因共沉默后核聚小体的表达45-47
• 4.3 实验数据与结果47-50
• 4.3.1 沉默FANCM和USP1基因及两个基因共沉默后SK-MES-1 细胞FANCD2蛋白表达和单泛素化水平47-50
• 4.3.2 沉默FANCM和USP1基因及两个基因共沉默后SK-MES-1 细胞核聚小体的表达变化50
• 4.4 数据与结果分析50-52
• 讨论52-58
• 结论与展望58-60
• 参考文献60-66
• 泛素化/去泛素化与肿瘤发生发展的研究进展（综述）66-74
• 参考文献70-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士期间发表的论文75

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