高山离子芥基因Cb4773的克隆及其在非生物胁迫中的作用研究

发布时间：2017-05-22 10:09

  本文关键词：高山离子芥基因Cb4773的克隆及其在非生物胁迫中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高山离子芥是一种典型的多年生草本植物,属于十字花科,它可以长期生长在随时变化的低温环境中,主要分布于新疆天山。高山离子芥适应低温的能力很强,可能与体内特定基因相关,能及时的应对这种恶劣的环境。目前高山离子芥适应低温环境的机理仍不清楚。研究这种适应低温环境的机理,对农作物适应恶劣环境及提高产量有帮助作用。本实验室前期研究表明,高山离子芥果胶甲基酯酶抑制剂基因Cb4773在冷胁迫下表达上升最明显,可能对高山离子芥适应低温具有重要的功能。本论文克隆高山离子芥基因Cb4773和拟南芥的同源基因At5g62360并过表达拟南芥研究其生物学功能及特征,本文主要研究内容与结果如下:1.通过RACE和Tail-PCR方法,获得Cb4773基因编码序列和启动子区域序列,编码区序列含有591bp,启动子序列含有1320bp。BLAST对比得到编码序列与拟南芥基因At5g62360序列在进化关系中相似度为88%。并分析它们序列和蛋白结构特征,发现它们含有同功能的PMEI结构域,并基因Cb4773含有跨膜结构域。2.基因Cb4773和At5g62360启动子序列连接GUS报告基因,GUS组织染色得到它们分别定位在根中、叶片、果荚、花丝和柱头上。通过Cb4773和At5g62360编码区链接YFP基因的载体构建,通过共聚焦得知亚细胞定位于细胞膜。3.过表达Cb4773和At5g62360基因后,获得的转基因植株在非生物胁迫下处理,发现转基因植物抗冻性和耐盐性提高。冷驯化后转基因植株的脯氨酸和总糖的含量增加。过表达基因Cb4773和At5g62360及Atpme41突变体都抑制了PME活性。PME活性的抑制造成转基因Cb4773和At5g62360植物早熟,及油菜素内酯缺失突变体det2表型恢复,比如根的生长,茎的分枝等。我们实验得出的这些结论,在植物以后应对非生物胁迫中起到重要的研究意义。实验中通过RT-PCR结果得出这两个基因的表达受到低温的诱导,LT50的测定得出过表达后植株半致死温度低于野生型,具有更强的抗冻性。此外,过表达这些基因出现的表型在以后的作物提前成熟及培育新品种有极大帮助。
【关键词】：高山离子芥 拟南芥 果胶甲基酯酶 果胶甲基酯酶抑制剂 果胶 细胞壁 抗冻性
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩写词表7-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 植物细胞壁的组成与结构特征13-14
• 1.2 植物细胞壁果胶的合成及其调节14-18
• 1.2.1 PME与PMEI基因家族特征15-17
• 1.2.2 PMEI对PME的作用模式17-18
• 1.3 细胞壁果胶与非生物胁迫之间的关系18-21
• 1.3.1 PMEI在胁迫作用中的研究进展18
• 1.3.2 植物在盐胁迫下抗逆性研究18-19
• 1.3.3 植物在冷冻胁迫下抗性研究19-20
• 1.3.4 PMEI与油菜素内脂之间的联系20-21
• 1.4 高山离子芥耐寒机理研究21-22
• 1.5 本论文的研究目的及意义22
• 第二章 实验材料和方法22-37
• 2.1 高山离子芥Cb4773基因克隆22-29
• 2.1.1 高山离子芥材料获取总RNA的提取22-23
• 2.1.2 高山离子芥RNA提取及反转录23
• 2.1.3 采用 3’RACE and 5’RACE技术获得Cb4773基因编码区序列23-27
• 2.1.4 采用Tail PCR获得Cb4773基因 5’UTR上游序列27-29
• 2.2 Gateway技术构建过表达载体及转化29-32
• 2.2.1 实验材料29
• 2.2.2 目的基因CDS区PCR扩增29-30
• 2.2.3 构建入门克隆及表达载体30-31
• 2.2.4 农杆菌转化及转基因植株筛选31-32
• 2.3 Gateway技术构建目的基因Promoter::GUS载体及转化32-33
• 2.3.1 基因组DNA提取32
• 2.3.2 目的基因启动子区PCR扩增32
• 2.3.3 构建入门克隆及表达克隆32-33
• 2.3.4 农杆菌转化及转基因植株筛选33
• 2.4 Cb4773和At5g62360非生物胁迫表达量检测33-34
• 2.4.1 实验材料及处理33
• 2.4.2 实验方法33-34
• 2.5 转基因植株gus染色34-35
• 2.5.1 实验中引物设计34-35
• 2.6 转基因植株耐冻性研究35
• 2.6.1 实验材料及处理35
• 2.6.2 LT50测定35
• 2.7 转基因植株耐盐性研究35-36
• 2.7.1 实验方法及处理35-36
• 2.7.2 植株根长及成活率统计36
• 2.8 PME活性测定36
• 2.9 脯氨酸及总糖含量测定36-37
• 第三章 实验结果37-61
• 3.1 高山离子芥Cb4773基因序列获得及同源性分析37-42
• 3.1.1 3’RACE and 5’RACE技术克隆获得Cb4773基因序列37-38
• 3.1.2 序列同源性分析得到拟南芥果胶酯酶抑制酶家族基因38-41
• 3.1.3 编码区克隆载体构建41-42
• 3.2 启动子序列获得及顺势作用元件分析42-44
• 3.2.1 Tail PCR获取Cb4773启动子序列42
• 3.2.2 启动子序列顺势作用元件分析42-44
• 3.2.3 启动子克隆载体构建结果44
• 3.3 转基因植株是否成功筛选及表达情况鉴定44-45
• 3.4 RT-PCR分析胁迫响应情况45-46
• 3.5 Gus组织染色46-48
• 3.6 亚细胞定位48
• 3.7 Cb4773/At5g62360耐受性分析48-55
• 3.7.1 过表达line的RT-PCR分析表达情况48-49
• 3.7.2 过表达Cb4773/At5g62360抗冻性分析49-51
• 3.7.3 过表达Cb4773/At5g62360抗盐性分析51-55
• 3.8 过表达Cb4773/At5g62360PME活性及生理指标测定55-59
• 3.8.1 过表达Cb4773/At5g62360脯氨酸和总糖测定55-58
• 3.8.2 过表达Cb4773/At5g62360 PME活性测定58-59
• 3.9 转基因Cb4773/At5g62360植株的表型59-60
• 3.10 基因AtPME41部分恢复det2的表型60-61
• 第四章 讨论61-64
• 4.1 基因Cb4773与At5g62360在序列进化比较61
• 4.2 启动子分析及亚细胞定位61-62
• 4.3 过表达Cb4773和At5g62360提高抗冻性62
• 4.4 过表达Cb4773和At5g62360改变PME活性及影响植物62-63
• 4.5 AtPME41与BR之间的联系63-64
• 第五章 结论及展望64-66
• 5.1 主要结论64
• 5.2 研究展望64-66
• 参考文献66-71
• 致谢71

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本文编号：385364