月季抗病基因同源序列的研究及杂交群体的构建

发布时间：2017-05-22 11:20

  本文关键词：月季抗病基因同源序列的研究及杂交群体的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：现代月季有近3万个品种,由于其生态适应范围广、花期长、花色丰富、株型多样,在园林绿化、鲜切花、家居装饰等方面都有广泛的应用。然而,黑斑病是露地栽培月季最常见的病害,严重影响了月季的观赏性和经济价值。因此通过对月季品种/种的抗性筛选,获得黑斑病抗性有差异的亲本；以此为基础,克隆与分离月季抗病基因同源序列(RGA),筛选与黑斑病抗性相关联的候选基因。以不同黑斑病抗性和花色的月季品种或种进行杂交,构建后代分离群体；开发合适的SSR标记,研究后代群体的遗传多样性和性状分离情况；该研究为月季抗病群体的构建和抗病基因的分离克隆提供理论基础,并为培育观赏性状优良、抗病性强的月季新品种提供了丰富的材料。1.通过对抗病性状的田间调查,对现有蔷薇属资源进行了评价,得到高度感病的品种7个,感病品种6个,低抗品种10个,中抗品种/种15个,高抗品种/种13个。在抗病评价的基础上,为了进一步挖掘与抗病相关的基因,进行了月季RGA的分离与鉴定。在转录组测序数据分析的基础上,设计6对简并引物,分别从现代月季品种‘杨基歌’(Rosa.'Yankee Doodle')、疏花蔷薇(R.1axa)、‘白玫瑰’(R. rugosa'White')上克隆了NBS-LRR-RGA;挑取750个克隆进行序列分析,氨基酸序列比对发现所克隆RGA均含有完整的NBS结构域：P-Loop,kinase-2,kinase-3a和GLPL;并构建了系统进化树。从系统发育树可看出,所克隆RGA与已克隆的其他植物的R基因的亲缘关系较近,分为nonTIR-NBS-RGA和TIR-NBS-RGA2个大类,10个进化枝,其中所克隆得到的nonTIR-NBS-RGA的比例远大于TIR-NBS-RGA的比例。筛选出进化树不同家族的6个RGAs,从它们的表达分析可看出,这些RGAs都不同程度、不同时间地参与了抗病反应,推测其中3个RGAs与抗病的相关性比较大。2.为了培育新奇花色、抗黑斑病的新优品种,选用筛选出来的抗黑斑病能力较强的白玉堂、单瓣黄刺玫、报春刺玫、玫瑰作为父本,生长健壮、开花能力较强的9个月季品种作为母本,设计远缘杂交组合20个；杂交结果显示,杂交亲和性较高的组合有：‘雪山娇霞’×报春刺玫、‘雪山娇霞’×单瓣黄刺玫、‘橘红潮’×玫瑰、‘花房’×白玉堂,结实率在10.91-37.5%之间。品种间杂交选用黑斑病抗性、花色有差异的19个月季品种,共设计51个杂交组合,品种间杂交亲和性较好的组合有10个。结合远缘杂交、品种间杂交、花粉生活力测定以及母本自然授粉结实情况的调查,筛选出适合做母本的月季品种有：‘绯扇’、‘电子表’、‘曼哈姆’、‘花房’、‘红帽子’、‘橘红潮’和‘雪山娇霞’；适合做父本的月季品种有‘电子表’、‘红法兰西’和‘绯扇’。3.为开发适合月季的SSR分子标记并进行性状关联分析及遗传多样性评价,从本课题组转录组数据中设计SSR引物80对,筛选出具有目的条带的SSR引物44对,具有多态性的SSR引物28对。用所开发的标记对其中一个杂交群体‘电子表’ב红法兰西’的遗传多样性进行了评价,该群体遗传距离在0.52-0.94之间；后代聚类分析结果与后代的花色分离结果有一定相关性,后代群体聚为两大类,其中一类跟母本‘电子表’(HT-13)聚为一类,花色大多是黄色；另一类跟父本‘红法兰西’(HT-12)聚在一起,花色普遍为红色到粉色之间。
【关键词】：月季 抗病性筛选 RGA 亲和性评价 SSR
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.8
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词8-12
• 1 引言12-22
• 1.1 月季黑斑病研究进展13-17
• 1.1.1 月季黑斑病病原及发病症状规律13-14
• 1.1.2 月季抗黑斑病评价14
• 1.1.3 月季抗病基因研究进展14-15
• 1.1.3.1 亮氨酸拉链(leucine zipper,LZ)14-15
• 1.1.3.2 果蝇的Toll蛋白及哺乳动物的白介素-1受体(Toll-interleukin-1 receptor,TIR)15
• 1.1.3.3 核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)15
• 1.1.3.4 富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat,LRR)15
• 1.1.4 RGA研究进展15-17
• 1.2 月季杂交育种研究进展17-19
• 1.2.1 传统杂交育种17-18
• 1.2.2 诱导二倍体蔷薇植株加倍与现代月季杂交18-19
• 1.3 分子标记辅助育种19-20
• 1.3.1 分子标记辅助育种简介19
• 1.3.2 SSR概述及在月季中的应用概况19-20
• 1.3.2.1 遗传多样性20
• 1.3.2.2 亲缘关系鉴定20
• 1.3.2.3 遗传图谱构建20
• 1.4 研究的目的意义20-21
• 1.5 技术路线21-22
• 2 月季品种的黑斑病抗性评价及RGA的研究22-38
• 2.1 材料与方法22-28
• 2.1.1 植物材料22-24
• 2.1.1.1 黑斑病抗性评价22-23
• 2.1.1.2 RGA克隆23-24
• 2.1.1.3 RGA表达分析24
• 2.1.2 黑斑病抗性评价24
• 2.1.3 转录组测序材料处理24-25
• 2.1.4 RGA克隆与分离25-26
• 2.1.4.1 简并引物设计25
• 2.1.4.2 PCR扩增和目的片段克隆25-26
• 2.1.4.3 RGA的克隆26
• 2.1.5 蔷薇属抗病基因同源序列系统发育分析26
• 2.1.6 月季RGA的表达特性分析26-28
• 2.1.6.1 RNA提取26
• 2.1.6.2 RNA反转录获得cDNA26-27
• 2.1.6.3 荧光定量PCR27-28
• 2.2 结果与分析28-35
• 2.2.1 田间抗病性调查结果统计28-30
• 2.2.2 转录组测序数据分析30
• 2.2.3 RNA质检30
• 2.2.4 月季NBS-LRR-RGAs的克隆30-31
• 2.2.5 月季NBS类RGA的推导氨基酸序列分析31
• 2.2.6 月季NBS-LRR-RGAs的系统发育分析31-34
• 2.2.7 候选RGA的表达分析34-35
• 2.3 讨论35-38
• 3. 杂交群体的构建38-50
• 3.1 材料与方法38-39
• 3.1.1 植物材料38
• 3.1.2 杂交方法38-39
• 3.1.2.1 花粉收集与活力测定38
• 3.1.2.2 杂交方法38-39
• 3.1.2.3 杂交后养护管理及座果统计39
• 3.1.2.4 种子沙藏与出苗率统计39
• 3.1.2.5 所涉及母本自然授粉结实情况的调查39
• 3.2 结果与分析39-47
• 3.2.1 花粉活力测定39-40
• 3.2.2 母本自然授粉结实情况调查40-41
• 3.2.3 蔷薇与月季远缘杂交亲和性评价41-43
• 3.2.4 月季品种间杂交亲和性评价43-45
• 3.2.5 适合做亲本的月季品种45-47
• 3.3 讨论47-50
• 4 SSR标记的开发及杂交群体遗传多样性评价50-64
• 4.1 材料与方法50-51
• 4.1.1 植物材料50
• 4.1.2 样品基因组DNA的提取及检测50
• 4.1.3 引物设计50
• 4.1.4 PCR扩增50
• 4.1.5 多态性筛选50-51
• 4.1.6 荧光SSR分析51
• 4.2 结果与分析51-59
• 4.2.1 SSR引物设计与筛选51-56
• 4.2.2 等位基因片段大小测定56-57
• 4.2.3 遗传多样性评价57-59
• 4.3 讨论59-64
• 5 结论64-66
• 5.1 现有资源的抗性评价64
• 5.2 月季RGA的主要特点64
• 5.3 杂交群体的构建64
• 5.4 适宜月季有性杂交群体的SSR标记64-66
• 参考文献66-72
• 个人简介72-74
• 导师简介74-76
• 硕博期间学术成果76-78
• 致谢78

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