增龄性胸腺萎缩相关基因的检测及成年小鼠胸腺上皮细胞的分离富集

发布时间：2017-05-22 20:24

  本文关键词：增龄性胸腺萎缩相关基因的检测及成年小鼠胸腺上皮细胞的分离富集，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胸腺是机体内重要的淋巴器官,空间上有序地指导淋巴前体细胞发育为成熟T细胞,为外周提供免疫应答的“主力军”。但是青春期后胸腺发生增龄性萎缩,功能逐渐丢失,导致初始T细胞输出进行性减少,制约了外周T细胞的多样性,使感染、自身免疫病的患病风险增加。前期研究发现胸腺微环境的改变而非造血干细胞功能/数量的减少,可能是增龄性胸腺萎缩的主要诱因。其中TECs是胸腺微环境中最重要的细胞成分,但是由于其数量少,分离较困难,使得TECs相关研究进展缓慢。本研究以小鼠胸腺为研究对象,分析增龄性胸腺萎缩过程中胸腺的形态变化及TECs特异性基因的表达变化之间的关系,同时优化成年TECs的分离富集方法,为进一步揭示胸腺免疫衰老的机制、TECs建系及再生胸腺等相关研究提供理论依据。目的:(1)探讨增龄性胸腺萎缩过程中胸腺的形态变化及TECs重要分化发育基因的表达变化之间的关系,以阐明胸腺微环境对增龄性胸腺萎缩的诱导作用;(2)探寻一种具有准确体内代表性的高效TECs分离富集方法,以期为后续分子谱系分析、TECs体外建系提供高丰度的TECs。材料和方法:(1)小鼠胸腺增龄性萎缩实验BABL/c小鼠按年龄分为A,B,C 3组,每组2只小鼠,实验独立重复3次,共18只。A组:1月龄小鼠;B组:4月龄小鼠;C组:16月龄小鼠。每组小鼠,一只用于做石蜡包埋,通过HE染色观察各组胸腺形态学变化;一只用于提取RNA,通过realtime-PCR检测各组胸腺TECs重要分化发育基因Fox N1、AIRE和Dll4的基因表达水平。(2)TECs分离富集实验6~8周龄BABL/c小鼠分为9组,每组3只,实验独立重复3次,共81只。小鼠TECs分离实验根据酶的种类与工作浓度随机分成5个分离组:collagenase V 1.0g·L~（-1）组和Liberase TM 0.5、0.7、1.0及2.0 U?m L-1组。采用分离实验得出的最适酶分离浓度(Liberase TM 1.0 U?m L-1)进行TECs的分离与富集。富集实验分为4组:未进行富集处理的对照组和MACS、Percoll及Ficoll富集组。各实验的细胞悬液通过流式细胞术检测细胞活力、TSCs比例以及TSCs中TECs重要标志上皮细胞黏附分子(Ep CAM)的表达丰度,Percoll富集组与对照组还进行TECs的2个亚群——皮质TECs(c TECs)和髓质TECs(m TECs)比例的检测。结果:(1)小鼠胸腺增龄性萎缩实验A组胸腺皮、髓质区结构比较完整,皮、髓质交界清晰;B组胸腺结构出现脂肪空泡,但皮、髓质交界暂且可辨,PVS区暂无脂肪浸润;C组胸腺结构出现多处空泡结构以及大面积的囊肿结构,PVS区被脂肪组织浸润。此外,B组Fox N1、AIRE、Dll4 3个基因的相对表达量均明显低于A组(P0.0001),但其均明显高于C组(P0.05),即3个基因表达均增龄性减少。(2)TECs分离富集实验Liberase TM 1.0 U?m L-1组中TSCs的产量明显高于Liberase TM 0.5和0.7 U?m L-1组(P0.01),并且其细胞活力及消化时间均优于collagenase V 1.0g·L~（-1）组(P0.01);3个富集组的细胞活力均较高,且组间比较差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较,3个富集组TECs比例显著增加(P0.05或P0.01);在3个富集组中,Percoll富集组富集的TECs比例高于其他2个富集组(P0.01);与对照组比较,Percoll富集组c TECs和m TECs的百分比及c TEC/m TEC的比值无明显变化(P0.05)。结论:(1)在胸腺微环境中,Fox N1基因的增龄性丢失诱发TECs减少,进一步导致TECs特异性基因AIRE、Dll4表达增龄性降低,胸腺功能性组织逐渐减少,脂肪组织逐渐浸润胸腺组织,致使老年胸腺髓质区出现囊肿、PVS区脂肪化,从加工(阳性选择)、检验(阴性选择)、运输(PVS区)三重环节阻碍胸腺细胞生成作用,最终弱化衰老胸腺的功能。(2)Liberase TM较collagenase V更适用于消化成年小鼠胸腺,且其最适消化浓度为1.0 U?m L-1。本研究采用的3种富集方法均可以提高TECs比例,对细胞的破坏均较小;且Percoll富集法最有效,在富集后不影响TECs亚群细胞比例,便于后续实验操作。
【关键词】：胸腺 增龄性胸腺萎缩 胸腺上皮细胞 分离富集
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R583
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文缩略词对照表12-15
• 第1章 绪论15-16
• 第2章 综述16-23
• 2.1 胸腺的结构、功能及器官发生16-18
• 2.2 胸腺的增龄性萎缩18-21
• 2.3 TECs分离方法的研究现状21-23
• 第3章 材料和方法23-32
• 3.1 主要试剂和设备23-25
• 3.1.1 试剂23-24
• 3.1.2 器材与仪器24-25
• 3.2 主要试剂配制25-26
• 3.3 实验动物26
• 3.3.1 实验动物26
• 3.3.2 实验动物分组26
• 3.4 实验方法26-31
• 3.4.1 样品采集26
• 3.4.2 石蜡切片及HE染色26-27
• 3.4.3 Realtime-PCR27-29
• 3.4.4 细胞悬液的制备29
• 3.4.5 分离实验29
• 3.4.6 富集实验29-30
• 3.4.7 流式细胞术检测30-31
• 3.5 统计学分析31-32
• 第4章 结果32-41
• 4.1 增龄性胸腺萎缩实验32-35
• 4.1.1 各组胸腺组织的形态学变化32-33
• 4.1.2 各组胸腺组织基因表达水平的检测33-35
• 4.2 TECs的分离实验35-37
• 4.2.1 消化时间35
• 4.2.2 细胞活力35
• 4.2.3 TSCs的产量35
• 4.2.4 TECs的产量35-37
• 4.3 TECs的富集实验37-41
• 4.3.1 3种TECs富集方法的细胞活力、TSCs和TECs比例37-39
• 4.3.2 Percoll富集组中c TECs与m TECs的比例39-41
• 第5章 讨论41-45
• 5.1 增龄性胸腺萎缩实验41-42
• 5.2 TECs的分离实验42-43
• 5.3 TECs的富集实验43-45
• 第6章 结论45-46
• 参考文献46-52
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果52-53
• 致谢53

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