禾谷镰刀菌Rab7基因调控DON毒素生物合成的分子机制研究

发布时间：2017-05-23 08:04

  本文关键词：禾谷镰刀菌Rab7基因调控DON毒素生物合成的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小麦赤霉病的主要病原菌之一,染赤霉病小麦可产生DON毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇,Deoxynivalenol),影响农产品品质和食品安全。禾谷镰刀菌产生DON毒素的合成途径已有大量研究,但对DON毒素合成的调控机制仍不十分明确,这是防控DON毒素污染的主要难题。因此,深入研究DON毒素的调控机制,对于有效控制DON毒素污染具有重要意义。本课题选择FgRab7作为调控禾谷镰刀菌产毒的关键因子,研究对DON毒素生物合成的调控机制,旨在通过基因调控作用削减DON毒素污染水平,为农业病害控制奠定理论基础。对禾谷镰刀菌野生型PH-1和FgRab7敲除突变体进行表型分析,结果发现,缺失FgRab7型生长速度减慢,产孢量明显下降。Elsia法检测野生型PH-1和FgRab7敲除突变体及FgRab7互补突变体不同时期DON毒素积累量发现敲除FgRab7菌株的DON毒素合成量显著降低,35d的产毒量较野生型降低近11倍;互补FgRab7的菌株产毒特性试验,发现35d产毒量比敲除突变体增高了6.9倍,说明FgRab7对禾谷镰刀菌产生DON毒素有重要作用。为了阐明Rab7调控DON毒素生物合成的分子调控机制,利用酵母双杂交技术研究了FgRab7对DON毒素合成相关基因的互作。构建pGADT7-Tri3和pGBKT7-Rab7诱饵载体并共转化至酵母AH109中,酵母转化子在四缺培养基(SD/-Ade-/Leu-/Trp-/His)上能够正常生长且在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal平板上菌落显蓝色,证明了FgRab7与Tri3基因有相互作用。采用荧光定量PCR的方法研究FgRab7对Tri基因的表达,对野生型菌株PH-1和FgRab7敲除突变体菌株在不同时期Tri3、Tri4、Tri5、Tri6、Tri101基因的表达量分析。结果表明,在野生型菌株和FgRab7敲除突变体菌株中,随培养时间延长,各个Tri基因的表达量逐步增高,35d时表达量达到最大;但在同一培养时间点FgRab7敲除突变体中的Tri基因表达量明显低于野生型,推断FgRab7通过调控Tri基因的表达减少了DON毒素的合成量。综上所述,本论文证明禾谷镰刀菌FgRab7在DON毒素合成中有重要作用,发现FgRab7与Tri3基因有明确的互作关系,FgRab7通过调控相关Tri基因的表达影响DON毒素的合成。
【关键词】：禾谷镰刀菌 FgRab7 Tri3 DON毒素 调控
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.121.45
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 前言12-25
• 1.1 研究背景12-23
• 1.1.1 小麦赤霉病12-13
• 1.1.2 DON毒素的危害及检测方法13-14
• 1.1.3 DON合成途径及相关Tri基因的研究14-17
• 1.1.4 Rab及调控研究概述17-18
• 1.1.5 调控DON毒素机制的研究进展18-23
• 1.2 本论文的研究目的及意义23
• 1.3 本论文主要研究内容与创新点23-25
• 1.3.1 研究内容23-24
• 1.3.2 创新点24-25
• 2 材料与方法25-42
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 供试菌株25
• 2.1.2 培养基25-26
• 2.1.3 常用生化试剂、试剂盒及有关溶液26-27
• 2.1.4 仪器与设备27-28
• 2.2 实验方法28-42
• 2.2.0 FgRab7的生物信息学分析28
• 2.2.1 禾谷镰刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突变体DON毒素的测定28-30
• 2.2.2 禾谷镰刀菌基因组DNA提取30
• 2.2.3 DON合成过程中相关Tri基因的扩增30-31
• 2.2.4 禾谷镰刀菌基因组RNA提取及纯化31-32
• 2.2.5 RT-PCR反转录32-33
• 2.2.6 实时荧光定量PCR33-34
• 2.2.7 pGBKT7- Rab7诱饵载体、pGADT7- Tri3融合载体的构建34-37
• 2.2.8 酵母质粒的制备与转化37-38
• 2.2.9 酵母质粒的提取38-39
• 2.2.10 诱饵载体质粒转化酵母菌株AH109及转化子验证39-40
• 2.2.11 重组质粒对酵母菌株AH109的细胞毒性检测40-41
• 2.2.12 重组质粒自激活检测41
• 2.2.13 酵母双杂交验证重组质粒pGBKT7- Rab7和pGADT7- Tri3的互作关系41-42
• 3 结果与分析42-58
• 3.1 Rab7生物信息学分析42-44
• 3.1.1 Rab7保守域分析42-43
• 3.1.2 Rab7蛋白系统进化分析43-44
• 3.2 禾谷镰刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突变体的表型分析44-45
• 3.2.1 禾谷镰刀菌生长观察44-45
• 3.2.2 禾谷镰刀菌孢子形态观察及产孢量统计45
• 3.3 禾谷镰刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突变体的DON毒素检测45-48
• 3.4 禾谷镰刀菌Rab7与Tri3的互作分析48-53
• 3.4.1 pGADT7- Tri3、pGBKT7- Rab7基因诱饵载体的构建及酵母转化子的验证48-50
• 3.4.2 重组质粒pGADT7- Tri3、pGBKT7- Rab7的细胞毒性检测及自激活检测50-52
• 3.4.4 pGADT7- Tri3和pGBKT7- Rab7的互作蛋白的鉴定52-53
• 3.5 DON合成途径中Tri基因的扩增53-55
• 3.5.1 DNA提取53-54
• 3.5.2 Tri基因扩增54-55
• 3.6 实时定量PCR表达分析55-58
• 3.6.1 RNA提取55
• 3.6.2 标准曲线55-56
• 3.6.3 Tri基因的表达与分析56-58
• 4 小结与讨论58-61
• 4.1 禾谷镰刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突变体的表型分析及DON毒素的量58-59
• 4.2 FgRab7与Tri3的相互作用59
• 4.3 FgRab7对Tri基因表达的作用59-61
• 参考文献61-68
• 致谢68-69
• 个人简历69

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