mTORC1磷酸化Ago2 387丝氨酸位点对miRNA介导的基因静默效应的影响

发布时间：2023-10-22 11:44

　　研究背景及目的:mRNA翻译调控机制一直是细胞生物学领域的一个重要科学问题和研究热点,这不仅因为它有助于我们掌握细胞生物学行为及功能的发生机制,而且有助于我们了解个体发育以及众多疾病发生、发展的分子机制,为探索疾病的防治提供新的理论和药物筛选靶点。真核细胞mRNA在细胞核中转录、剪切后输出到细胞质中翻译形成细胞蛋白,在细胞质中多种信号通路的调节下进行翻译后修饰,从而发挥蛋白质的生物学功能。机制性雷帕霉素靶分子(mechanistic target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,mTOR以mTORC1和mTORC2两种复合物形式存在,参与细胞代谢、增殖迁移和自噬凋亡等过程。研究表明mTORC1通过磷酸化其下游底物4E-BP促进mRNA的翻译,而由mi RNA与靶mRNA、Ago蛋白、GW182蛋白等结合形成的mi RNA介导的静默复合体(RISC)是负性调控mRNA翻译的重要机制。那么,细胞作为一个整体是如何协调这两种相反的mRNA翻译调控机制的呢?mTORC1是否以及如何调控RISC-mi RNAs功能的呢?既往研究主要集中于mTORC1...

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摘要
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 mTOR信号通路
    1.2 mTOR信号通路的调控
    1.3 miRNA
    1.4 mRNA翻译的调控
    1.5 RISC
        1.5.1 Ago2在基因静默中的作用
        1.5.2 GW182在基因静默中的作用
    1.6 小结
第二章 研究目的、方法、内容和意义
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法
    2.3 研究内容
        2.3.1 mTORC1与Ago2蛋白结合及机制研究
        2.3.2 mTORC1对Ago2387 丝氨酸位点磷酸化水平影响
        2.3.3 mTORC1磷酸化Ago2387 丝氨酸位点对其功能影响
    2.4 研究意义
第三章 mTORC1与Ago2蛋白结合及机制研究
    3.1 材料
        3.1.1 细胞株、质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要试剂配制
        3.1.4 主要实验仪器
    3.2 方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 细胞转染
        3.2.3 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
        3.2.4 蛋白免疫印迹技术
        3.2.5 GST-Pulldown实验
        3.2.6 质粒构建
    3.3 结果
        3.3.1 mTORC1与Ago2蛋白结合
        3.3.2 mTORC1与Ago2 PAZ结构域结合
    3.4 讨论
第四章 mTORC1磷酸化Ago2387 丝氨酸位点及机制研究
    4.1 材料
        4.1.1 细胞株、质粒
        4.1.2 主要试剂
    4.2 方法
        4.2.1 体外激酶实验
        4.2.2 HA-Ago2387 丝氨酸位点突变体质粒构建
    4.3 结果
    4.4 讨论
第五章 mTORC1磷酸化Ago2 S387对其功能影响
    5.1 材料
        5.1.1 细胞株、质粒
        5.1.2 主要试剂
    5.2 方法
        5.2.1 RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）实验
        5.2.2 捆绑实验
        5.2.3 HA-Ago2 C端 5A/5E突变体质粒构建
        5.2.4 Crispr/Cas9细胞株构建ANKRD52-/-细胞株
    5.3 结果
        5.3.1 mTORC1激活后Ago2蛋白结合RNA能力减弱
        5.3.2 Ago2387 丝氨酸位点磷酸化水平影响GW182蛋白的结合
        5.3.3 Ago2387 丝氨酸位点磷酸化水平影响其静默功能
        5.3.4 Ago2 C端多个位点磷酸化水平对387丝氨酸位点磷酸化的影响
    5.4 讨论
第六章 结论与展望
参考文献
综述：mTOR信号通路与miRNA相互调控研究进展
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的论文及参加的会议



本文编号：3856452