真菌来源的嗜热果胶酶基因挖掘及其催化效率的改造

发布时间：2023-10-27 18:08

　　果胶酶作为添加剂广泛应用于食品行业的果汁澄清工艺中,发现和挖掘适用于工业应用的优质果胶酶,能够为工业应用提供更多的选择。本文从嗜热Talaromyces leycettanus JCM 12802菌株中克隆得到三个多聚半乳糖醛酸酶基因Tepg28a、Tepg28b、Tepg28c,其中一个为外切型两个为内切型,并全部在毕赤酵母GS115中实现高效异源表达。对纯化后的三个重组蛋白进行酶学性质的研究,其最适pH和最适温度均一致,分别为3.5和70 oC,三者在酸性至中性的环境中都具有很好的pH稳定性,在60 oC的高温环境下保持高度稳定性,同时在70oC中保温10 min后仍能剩余40%的剩余酶活,值得注意的是TePG28c的比活高达51786 U/mg,要高于目前报道所有多聚半乳糖醛酸酶。基于Tepg28a和Tepg28b为两种不同类型的多聚半乳糖醛酸酶,他们对聚糖切割方式的不同,在其添加比TePG28a:TePG28b=2:3(U:U)的时候对橘皮果胶表现出很好的协同作用,是单独使用一种酶的作用效果的240%,并且两个酶能够协同作用于天然葡萄汁的澄清,使葡萄汁的透光度从20%提升到80...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 果胶
        1.1.1 果胶的结构
        1.1.2 果胶的分类
    1.2 果胶酶
        1.2.1 果胶酶的分类
        1.2.2 果胶酶的应用
    1.3 多聚半乳糖醛酸酶的研究进展
        1.3.1 多聚半乳糖醛酸酶的来源
        1.3.2 多聚半乳糖醛酸酶的结构
        1.3.3 多聚半乳糖醛酸酶的功能
        1.3.4 多聚半乳糖醛酸酶的性质
    1.4 酶的分子改造策略
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 Talaromyces leycettanus JCM 12802 来源嗜热多聚半乳糖醛酸酶基因的挖掘
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和载体
        2.1.2 培养基和溶液的配制
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 生化试剂、试剂盒和工具酶
    2.2 实验方法
        2.2.1 多聚半乳糖醛酸酶的酶活标准曲线的制作
        2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶酶活的测定
        2.2.3 T. leycettanus JCM12802菌株产多聚半乳糖醛酸酶的评估
        2.2.4 T. leycettanus JCM12802来源多聚半乳糖醛酸酶基因的获取
        2.2.5 T. leycettanus JCM12802多聚半乳糖醛酸酶基因c DNA序列的扩增
        2.2.6 T. leycettanus JCM 12802 中聚半乳糖醛酸酶表达载体的构建
        2.2.7 T. leycettanus JCM 12802 多聚半乳糖醛酸酶的酵母表达
        2.2.8 多聚半乳糖醛酸酶的纯化、脱糖基及定量
    2.3 结果与分析
        2.3.1 多聚半乳糖醛酸酶的酶活标准曲线
        2.3.2 T. leycettanus JCM12802菌株产多聚半乳糖醛酸酶的评估
        2.3.3 T. leycettanus JCM12802聚半乳糖醛酸的基因获取及分析
        2.3.4 T. leycettanus JCM12802多聚半乳糖醛酸酶的表达质粒构建
        2.3.5 多聚半乳糖醛酸酶的酵母表达及其蛋白纯化
    2.4 本章小结
第三章 Talaromyces leycettanus JCM 12802 来源多聚半乳糖醛酸酶的酶学性质研究及其协同应用的评估
    3.1 实验材料
        3.1.1 溶液的配制
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 生化试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 聚半乳糖醛酸酶的酶学性质研究
        3.2.2 动力学常数
        3.2.3 底物特异性
        3.2.4 产物分析
        3.2.5 内切型和外切型多聚半乳糖醛酸酶的协同作用
        3.2.6 葡萄汁的澄清实验
    3.3 结果与分析
        3.3.1 酶学性质分析
        3.3.2 动力学常数
        3.3.3 底物特异性
        3.3.4 产物分析
        3.3.5 协同作用
        3.3.6 葡萄汁澄清实验
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 多聚半乳糖醛酸酶催化效率的分子改造
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 培养基和溶液的配制
        4.1.3 实验仪器
        4.1.4 生化试剂、试剂盒和工具酶
        4.1.5 野生型多聚半乳糖醛酸酶
    4.2 实验方法
        4.2.1 多聚半乳糖醛酸酶的同源建模和比对
        4.2.2 分子改造的策略
        4.2.3 点突变实验
        4.2.4 突变表达载体的酵母表达及纯化
        4.2.5 突变重组酶的酶学性质研究
    4.3 结果与分析
        4.3.1 Te PG28b和Bs PG28a的同源建模
        4.3.2 点突变载体的构建
        4.3.3 突变蛋白的表达和纯化
        4.3.4 突变体的酶学性质研究
    4.4 本章小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3857013