生物防治中腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟钙调磷酸酶A基因表达的影响

发布时间：2023-11-03 18:46

　　腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum Brischke是一种重要的内寄生蜂,亚洲玉米螟Osttinia furnacalis是一种重要的玉米害虫。本文采用转录组测序和实时荧光定量PCR,研究了腰带长体茧蜂寄生后对亚洲玉米螟幼虫4 h、24 h、48 h及未寄生对照组免疫相关基因的表达变化情况,克隆了与天然免疫相关的钙调磷酸酶A基因(CaNA),并进行了生物信息学分析,原核表达了 CaNA蛋白,进行了 CaNA基因的RNAi研究,为进一步研究CaNA功能打下基础,主要结果如下:(1)通过与NR数据库比对后,本实验中亚洲玉米螟基因序列对比到家蚕Bombyx mori的基因量最多,占总比例的18%。其次为黑脉金斑蝶Danaus plexippus,占总数的11.1%。对转录组基因进行GO注释之后,基因主要分为生物学过程、细胞成分和分子功能这三类。对基因做KO注释后,根据它们参与的KEGG代谢通路进行分类,在信号转导途径的基因最多。对转录组所有的免疫基因进行热图分析发现基因聚集成5个cluster,在数据中发现CaNA基因属于第四个cluster。(2)对寄生后 Of-GRP...

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
    1 生物防治与寄生蜂
    2 昆虫的天然免疫系统
    3 昆虫免疫相关基因的调控作用
    4 钙调磷酸酶的功能
    5 昆虫转录组研究进展
    6 研究目的和意义
    参考文献
第一章 腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟后转录组分析及免疫相关基因检测
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 供试昆虫
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
        2.4 对腰带长体茧峰寄生后亚洲玉米螟幼虫的转录组分析
            2.4.1 Total RNA的提取
            2.4.2 Oligo(dT)富集mRNA
            2.4.3 片段化mRNA
            2.4.4 反转录合成cDNA
            2.4.5 上机测序
            2.4.6 生物信息分析流程
        2.5 腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟后免疫相关基因表达的检测
            2.5.1 腰带长体茧蜂寄生4龄初亚洲玉米螟幼虫
            2.5.2 总RNA提取及质量检测
            2.5.3 总RNA质量检测
            2.5.4 cDNA的合成
            2.5.5 数据分析
    3 结果与分析
        3.1 原始测序数据质控
        3.2 测序错误率分布检查
        3.3 拼接转录本长度分布
        3.4 基因功能注释
            3.4.1 Nr注释结果
            3.4.2 GO分类
            3.4.3 KOG分类
            3.4.4 KEGG分类
        3.5 基因表达水平分析
            3.5.1 参考序列比对
            3.5.2 基因FPKM密度分布图
        3.6 差异表达分析
            3.6.1 样品间相关性检查
            3.6.2 差异基因筛选
            3.6.3 GO富集分析
            3.6.4 对照组与寄生后处理组不同时间免疫基因比较
        3.7 腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟后免疫相关基因表达水平分析
            3.7.1 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫GRP3基因转录水平表达的影响
            3.7.2 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫PAP基因转录水平表达的影响
            3.7.3 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫Serpin1基因表达的影响
            3.7.4 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫PPO2基因转录水平表达的影响
            3.7.5 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫DDC基因转录水平表达的影响
            3.7.6 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫JHDK基因转录水平表达的影响
    4 讨论
        4.1 腰带长体茧峰寄生后亚洲玉米螟幼虫的转录组分析
        4.2 腰带长体茧蜂茧蜂寄生后对亚洲玉米螟免疫基因的相关影响
        4.3 转录组测序的偏好性
        4.4 展望
第二章 亚洲玉米螟钙调磷酸酶A亚基(CaNA)的克隆及表达分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 供试昆虫
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
        2.4 亚洲玉米螟总RNA的提取及cDNA的合成
            2.4.1 总RNA的提取
            2.4.2 总RNA质量检测
            2.4.3 生成RACE-Ready cDNA
        2.5 Of-CaNA基因的3'RACE
            2.5.1 引物设计
            2.5.2 操作步骤
            2.5.3 目的基因片段的回收纯化
            2.5.4 目的片段与克隆载体连接
            2.5.5 连接载体转化
            2.5.6 单菌落PCR检测
            2.5.7 质粒DNA提取及测序
        2.6 Of-CaNA基因结构域序列的扩增
        2.7 Of-CaNA基因结构域序列的生物信息学分析
            2.7.1 亚洲玉米螟CaNA基因结构域编码蛋白的理化性质分析
            2.7.2 亚洲玉米螟CaNA基因编码蛋白的结构和功能分析
            2.7.3 基于Of-CaNA核苷酸序列推导的氨基酸序列系统进化树构建
        2.8 Of-CaNA重组蛋白原核表达
            2.8.1 重组表达质粒pET-28a(+)-Of-CaNA的构建
            2.8.2 重组表达
            2.8.3 表达蛋白的Western blotting鉴定
        2.9 腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟后CaNA基因表达的检测
            2.9.1 腰带长体茧蜂寄生4龄初亚洲玉米螟幼虫
            2.9.2 总RNA提取及质量检测
            2.9.3 cDNA的合成
        2.10 亚洲玉米螟幼虫注射CaNA-dsRNA后表达水平的检测
            2.10.1 CaNA RNAi引物设计
            2.10.2 dsRNA的制备
            2.10.3 亚洲玉米螟幼虫dsRNA的注射、取样及Real timePCR检测
        2.11 数据分析
    3 结果与分析
        3.1 Of-CaNA基因的克隆
            3.1.1 Of-CaNA基因cDNA序列的3'RACE
            3.1.2 Of-CaNA基因部分cDNA序列的克隆及序列验证
            3.1.3 Of-CaNA基因结构域的亚克隆
        3.2 Of-CaNA基因序列的生物信息学分析
            3.2.1 Of-CaNA基因结构域cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列
            3.2.2 Of-CaNA基因核苷酸序列和氨基酸序列的BlastP分析
            3.2.3 Of-CaNA基因的系统进化树
            3.2.4 Of-CaNA基因的信号肽、跨膜结构域及翻译后修饰分析
            3.2.5 Of-CaNA基因编码蛋白的二级结构、卷曲螺旋、疏水性和三维结构分析
        3.3 Of-CaNA基因的原核表达
            3.3.1 Of-CaNA-pET-28a基因表达载体的构建
            3.3.2 pET-28a-Of-CaNA原核表达条件的筛选
        3.4 腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟CaNA基因转录水平表达的影响
        3.5 亚洲玉米螟幼虫CaNA基因RNA干扰
            3.5.1 特异性T7引物与模板PCR
            3.5.2 CaNA dsRNA的制备验证
            3.5.3 亚洲玉米螟幼虫CaNA基因RNA干扰后CaNA表达水平分析
    4 讨论
        4.1 Of-CaNA基因的结构特征分析
        4.2 钙调磷酸酶调控昆虫免疫反应
        4.3 亚洲玉米螟幼虫CaNA基因RNAi
        4.4 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3859691