小鼠CDH1启动子驱动的双荧光蛋白报告基因载体的构建及活性检测

发布时间：2023-11-02 17:50

　　乳腺癌是女性最多发的一种癌症,其死亡率逐年增加,而乳腺癌致死的主要原因是癌细胞的转移,目前对乳腺癌转移的研究已经成为乳腺癌研究的热点。上皮细胞-间质细胞转化(EMT)是近些年被大家接受的乳腺癌转移模型。上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)是EMT的典型标志物,在EMT过程中,E-cadherin表达下调或缺失,所以E-cadherin的下调被认为是与乳腺癌浸润和转移正相关。然而在临床检测中,该基因在许多乳腺癌转移灶表现为高表达,因而其在乳腺癌发展及转移中的作用需要进一步深入的探讨。本文利用高表达E-cadherin并且高转移性小鼠乳腺癌细胞4T1为模型,通过构建E-cadherin基因(CDH1)启动子驱动的双荧光蛋白报告基因载体,采用流式细胞仪分选的方法分选出E-cadherin表达阳性和阴性细胞,进而对分选的细胞进行体外培养观察细胞的形态特征与差异,也为进一步研究两种不同细胞亚群的生物学行为建立基础。结果如下,激光共聚焦显微镜检查结果表明CDH1启动子驱动的双荧光蛋白报告基因载体构建成功,流式细胞仪分选后E-cadherin阳性和阴性细胞体外培养表现出明显差异,主要为CDH1阴性...

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第一章 文献综述
    1.1 乳腺癌及其分型
    1.2 乳腺癌转移机制
        1.2.1 发展模型
        1.2.2 临时隔间模型
        1.2.3 融合模型
        1.2.4 基因转移模型
        1.2.5 早期癌变模型
        1.2.6 上皮细胞-间质细胞转化模型(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)
        1.2.7 循环肿瘤细胞(CTCs)作为对EMT的补充
    1.3 EMT的三种类型及其相反的MET过程
        1.3.1 EMT的三种类型
        1.3.2 MET作为EMT的反过程
    1.4 EMT的标记物
        1.4.1 细胞表面标记物
        1.4.2 细胞骨架标记物
        1.4.3 细胞外基质标记物
        1.4.4 EMT相关的调控因子
    1.5 E-cadherin与EMT调控
        1.5.1 E-cadherin
        1.5.2 E-cadherin参与调控EMT
        1.5.3 TGF-β参与EMT调控
    1.6 E-cadherin与癌细胞转移的关系
        1.6.1 E-cadherin的缺失与癌细胞侵润的关系
        1.6.2 E-cadherin的表达与癌细胞转移的关系
    1.7 双荧光载体用于对E-cadherin的细胞标记
第二章 双荧光蛋白报告基因载体的构建
    2.1 材料
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器
        2.1.4 培养基
    2.2 方法
        2.2.1 Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.2 TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.3 CAAT-TATA-Kozak-mcherry-ployA片段的克隆
        2.2.4 pmCherry-pluspEGFP-N1载体的构建
        2.2.5 pEF1片段的克隆
        2.2.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1载体的构建
        2.2.7 重组质粒转染4T1细胞和共聚焦显微镜检测荧光蛋白活性
    2.3 结果
        2.3.1 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1载体可以同时表达两种荧光蛋白
第三章 小鼠CDH1启动子驱动的双荧光蛋白报告基因载体的构建及活性检测
    3.1 材料
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 试验主要试剂
        3.1.3 试验仪器
        3.1.4 培养基
        3.1.5 试验耗材
        3.1.6 网络资源及软件
    3.2 方法
        3.2.1 CDH1启动子(500bp、1000bp)引物设计
        3.2.2 4T1细胞复苏
        3.2.3 4T1细胞培养
        3.2.4 4T1细胞基因组DNA提取
        3.2.5 CDH1启动子(500、1000bp)扩增
        3.2.6 构建pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆载体
        3.2.7 双酶切pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)克隆载体和pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1(双荧光载体)
        3.2.8 构建pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Prompter(500bp)、pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)重组质粒
        3.2.9 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重组质粒测序鉴定
        3.2.10 重组质粒转染4T1细胞和共聚焦显微镜检测荧光蛋白活性
    3.3 结果
        3.3.1 4T1细胞基因组DNA提取
        3.3.2 CDH1基因启动子(500bp、1000bp)扩增
        3.3.3 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)菌落PCR鉴定
        3.3.4 pMD19-T Simple/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)载体和pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1双酶切结果
        3.3.5 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定结果
        3.3.6 pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(500bp、1000bp)重组质粒测序鉴定
        3.3.7 荧光蛋白活性的共聚焦显微镜检测
        3.3.8 启动子区域转录因子结合位点分析
第四章 CDH1阳性细胞和CDH1阴性细胞流式分选及体外培养观察
    4.1 材料
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 试验主要试剂
        4.1.3 试验仪器
        4.1.4 培养基
    4.2 方法
        4.2.1 4T1细胞培养及pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1/CDH1 Promoter(1000bp)转染
        4.2.2 分选前的细胞准备
        4.2.3 流式分选
        4.2.4 分选后的细胞培养
    4.3 结果
        4.3.1 E-cadherin阳性细胞和E-cadherin阴性细胞的流式分选结果
        4.3.2 E-cadherin阳性细胞和E-cadherin阴性细胞培养观察
第五章 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 E-cadherin的缺失是EMT及转移的必要不充分条件
        5.1.2 转移灶处有诱导E-cadherin表达的反式作用因子导致其在转移灶高表达
        5.1.3 E-cadherin是多条癌细胞通路的下游调控靶基因
    5.2 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表文章



本文编号：3859466