重组NOLC1基因腺病毒的构建及其对人肺腺癌细胞A549细胞活性和凋亡的影响
发布时间：2023-12-02 12:23
NOLC1蛋白是一个高度磷酸化的哺乳动物蛋白,既参与核仁的发生和rDNA的转录,又参与炎症发生、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生等相关信号通路的调控。已有研究报道,在鼻咽癌和肝癌的发生发展中,NOLC1起着至关重要的作用。但是,关于NOLC1蛋白在肺癌细胞中的作用还未有报道。本实验首先通过TOPO克隆法成功构建入门载体pENTR/D-TOPO-NOLC1,利用通路克隆系统技术成功构建pAd-CMV-V5-NOLC1表达载体,成功包装成腺病毒后,qRT-PCR和Western blot分别比较不同(5-100)MOIs的腺病毒感染A549细胞和HEL细胞后,两种细胞中NOLC1 mRNA量和蛋白量的表达情况。结果显示MOI=100时,两种细胞NOLC1的mRNA量和蛋白量最高,后续病毒感染实验均采用100MOI。MTT实验分析感染Ad-V5-NOLC1(过表达)和转染shRNA-NOLC1质粒(干扰)对HEL和A549细胞活力的影响,结果显示：NOLC1蛋白的过表达和干扰表达均促进A549细胞的活性降低,但是对HEL细胞影响很小。为确定细胞活性减少是由细胞凋亡引起还是由细胞坏死引起,采用An...
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
0.1 肺癌的基因治疗
0.2 基因治疗载体
0.3 NOLC1蛋白简介
0.4 细胞凋亡
0.5 本项目研究目的、内容及意义
第1章 重组NOLC1腺病毒载体的构建及其鉴定
1.1 实验方案
1.2 材料
1.2.1 引物设计
1.2.2 载体、细菌菌株
1.2.3 主要试剂
1.2.4 溶液配制(见附录A)
1.2.5 主要仪器及耗材(见附录B)
1.3 方法
1.3.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重组质粒的构建
1.3.2 重组pAd-CMV-V5-NOLC1腺病毒载体的构建
1.4 结果
1.4.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重组质粒的PCR鉴定
1.4.2 重组pAd-CMV-V5-NOLC1质粒的PCR鉴定
1.5 讨论
第2章 重组NOLC1腺病毒表达载体的包装及鉴定
2.1 实验方案
2.2 材料
2.2.1 细胞株、载体、细菌菌株
2.2.2 主要试剂
2.2.3 溶液配制(见附录A)
2.2.4 主要仪器及耗材(见附录B)
2.3 方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 腺病毒包装
2.3.3 重组腺病毒表达载体的Western blot验证
2.3.4 重组腺病毒的TCID50测定(组织半数感染量)
2.3.5 Real-time PCR方法检测细胞中mRNA表达量
2.3.6 Western blot方法检测细胞中蛋白表达量
2.4 结果
2.4.1 腺病毒包装结果
2.4.2 重组腺病毒表达载体的Western blot验证
2.4.3 重组腺病毒滴度TCID50的测定
2.4.4 Real-time PCR法检测HEL,A549细胞中mRNA表达量
2.4.5 Western blot方法检测HEL,A549细胞中蛋白表达量
2.5 讨论
第3章 NOLC1过表达及干扰表达对HEL和A549细胞增殖及凋亡的影响
3.1 实验方案
3.2 材料
3.2.1 细胞株、载体、细菌菌株
3.2.2 主要试剂
3.2.3 溶液配制(见附录A)
3.2.4 主要仪器及耗材(见附录B)
3.3 方法
3.3.1 MTT法检测细胞增殖
3.3.2 Annexin V-APC/PI双染法定量检测细胞凋亡
3.3.3 线粒体膜电位(JC-1)法检测细胞凋亡
3.3.4 qRT-PCR和western blot检测细胞通路凋亡因子mRNA表达量的变化
3.4 结果
3.4.1 MTT法检测细胞增殖
3.4.2 Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡
3.4.3 线粒体膜电位(JC-1)法检测细胞凋亡
3.4.4 NOLC1过表达对两种细胞凋亡因子mRNA和蛋白表达量的影响
3.5 讨论
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.2 展望
致谢
参考文献
附录A 主要仪器与耗材一览表
附录B 主要仪器与耗材一览表
攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况
本文编号：3869662
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
0.1 肺癌的基因治疗
0.2 基因治疗载体
0.3 NOLC1蛋白简介
0.4 细胞凋亡
0.5 本项目研究目的、内容及意义
第1章 重组NOLC1腺病毒载体的构建及其鉴定
1.1 实验方案
1.2 材料
1.2.1 引物设计
1.2.2 载体、细菌菌株
1.2.3 主要试剂
1.2.4 溶液配制(见附录A)
1.2.5 主要仪器及耗材(见附录B)
1.3 方法
1.3.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重组质粒的构建
1.3.2 重组pAd-CMV-V5-NOLC1腺病毒载体的构建
1.4 结果
1.4.1 pENTR/D-TOPO-NOLC1重组质粒的PCR鉴定
1.4.2 重组pAd-CMV-V5-NOLC1质粒的PCR鉴定
1.5 讨论
第2章 重组NOLC1腺病毒表达载体的包装及鉴定
2.1 实验方案
2.2 材料
2.2.1 细胞株、载体、细菌菌株
2.2.2 主要试剂
2.2.3 溶液配制(见附录A)
2.2.4 主要仪器及耗材(见附录B)
2.3 方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 腺病毒包装
2.3.3 重组腺病毒表达载体的Western blot验证
2.3.4 重组腺病毒的TCID50测定(组织半数感染量)
2.3.5 Real-time PCR方法检测细胞中mRNA表达量
2.3.6 Western blot方法检测细胞中蛋白表达量
2.4 结果
2.4.1 腺病毒包装结果
2.4.2 重组腺病毒表达载体的Western blot验证
2.4.3 重组腺病毒滴度TCID50的测定
2.4.4 Real-time PCR法检测HEL,A549细胞中mRNA表达量
2.4.5 Western blot方法检测HEL,A549细胞中蛋白表达量
2.5 讨论
第3章 NOLC1过表达及干扰表达对HEL和A549细胞增殖及凋亡的影响
3.1 实验方案
3.2 材料
3.2.1 细胞株、载体、细菌菌株
3.2.2 主要试剂
3.2.3 溶液配制(见附录A)
3.2.4 主要仪器及耗材(见附录B)
3.3 方法
3.3.1 MTT法检测细胞增殖
3.3.2 Annexin V-APC/PI双染法定量检测细胞凋亡
3.3.3 线粒体膜电位(JC-1)法检测细胞凋亡
3.3.4 qRT-PCR和western blot检测细胞通路凋亡因子mRNA表达量的变化
3.4 结果
3.4.1 MTT法检测细胞增殖
3.4.2 Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡
3.4.3 线粒体膜电位(JC-1)法检测细胞凋亡
3.4.4 NOLC1过表达对两种细胞凋亡因子mRNA和蛋白表达量的影响
3.5 讨论
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.2 展望
致谢
参考文献
附录A 主要仪器与耗材一览表
附录B 主要仪器与耗材一览表
攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况
本文编号：3869662
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