限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠

发布时间：2023-12-02 13:53

　　CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的快速基因编辑技术。通过该技术已对多种生物的基因组进行了编辑。由此产生的基因编辑动物的建系与鉴定是随之而来较为繁琐的工作。单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA)靶序列的设计和确定不仅影响后续靶向基因组的效率,还可作为优化鉴定、筛选方法的参考。本研究在选取sgRNA靶序列时,不仅依据软件的评分,还分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位点,以便对后续纯合子/杂合子进行鉴定。结果显示,以特异引物扩增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性内切酶BanⅡ切为两个片段;而纯合子小鼠"丢失"该酶切位点,其PCR产物不能被切开;杂合子小鼠PCR产物被不完全切开,凝胶电泳结果可见三条带。本研究结果提示该策略可有效简化基因编辑动物建系鉴定工作,提高鉴定效率及改善阳性动物辨识效果。

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1. 1 靶序列的选择
    1. 2 sgRNA及Cas9 mRNA的获得
    1. 3 T7EN1 酶切鉴定实验
    1. 4 显微操作F0 代鉴定与繁殖
    1. 5 Ban Ⅱ酶切实验
2 结果
    2. 1 Chrm3 基因gRNA的设计
    2. 2 sgRNA的细胞学验证
    2. 3 显微注射与F0 小鼠鉴定
    2. 4 Chrm3 基因编辑后编码产物的预测
    2. 5 纯合子与杂合子鉴定
    2. 6 Chrm3 基因编辑小鼠体型较小
3 讨论



本文编号：3869804