应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

发布时间：2024-01-04 20:28

　　目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 质粒与细胞株
        1.1.2 试剂与仪器
    1.2 方法
        1.2.1 引物设计与寡核苷酸合成
        1.2.2 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4载体构建及sgRNA活性筛选
            1.2.2. 1 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4载体构建
            1.2.2. 2 p U6-Rev-erbβsgRNA1-4活性检测
        1.2.3 hRev-erbβ打靶载体的构建
        1.2.4 细胞培养及转染
        1.2.5 Rev-erbβ稳定敲除HEK293细胞系的建立
        1.2.6 Rev-erbβ基因敲除HEK293细胞系的鉴定
            1.2.6. 1 PCR法对Rev-erbβ基因敲除的细胞株基因组水平的鉴定
            1.2.6. 2 实时定量PCR检测敲除Rev-erbβ基因细胞系的mRNA水平
            1.2.6. 3 Western blot法检测Rev-erbβ蛋白的表达
2 结果
    2.1 Rev-erbβsgRNA活性的筛选
    2.2 Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系的建立与鉴定
3 讨论



本文编号：3877019