裂殖酵母热激蛋白Hsp90促进多个基因沉默复合物组装参与异染色质形成

发布时间：2024-02-15 14:16

　　真核细胞的染色质可以分为常染色质和异染色质。己有的研究表明,异染色质在调控基因表达、维持基因组稳定性、细胞的发育分化以及肿瘤的表观调控等方面发挥着重要作用。至今,异染色质的形成及其功能一直没有完全研究清楚。已有的研究已经比较清楚地表明,裂殖酵母利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制在细胞核中染色质水平上直接介导异染色质的形成。Hsp90作为分子伴侣蛋白家族的一个特殊成员。它不仅参与蛋白的正确折叠维持蛋白稳态,而且参与许多重要的生物进程。近期的研究表明,在高等生物中热激蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)参与RNA诱导沉默复合物复合物(RISC)的组装从而影响RNAi介导的基因沉默。我们实验室前期研究发现,裂殖酵母中Hsp90突变体swol-26可以不同程度地解除插入在近着丝粒区、交配型区和rDNA区的报道基因的沉默。在此基础上,本研究的遗传学实验表明swol-26突变体可以使得在异位建立的RNAi介导的基因沉默产生缺陷,并且特异的破坏异染色质区的Hsp90导致近着丝粒区严重的基因沉默缺陷。通过生化实验,我们发现swol-26影响R...

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【学位级别】：硕士

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摘要
英文摘要
第一章 前言
    1 裂殖酵母中异染色质区
    2 RNAi与异染色质形成
        2.1 小干扰RNA的生成
        2.2 siRNA的代谢
        2.3 包含Ago1的基因沉默复合物
        2.4 RNAi正循环
        2.5 异染色质蛋白与异染色质的形成
        2.6 RNAi介导亚端粒区异染色质的形成
        2.7 Shelterin复合物介导近端粒区异染色质的形成
    3 热激蛋白HsP90
        3.1 人类细胞Hsp90
        3.2 Hsp90参与RNAi
    4 本论文的研究目的、内容和意义
第二章 材料和方法
    1 材料
        1.1 大肠杆菌
        1.2 酵母菌株
        1.3 质粒
        1.4 引物
        1.5 分子生物学工具酶
        1.6 主要试剂及耗材
        1.7 主要仪器及设备
        1.8 常用培养基以及主要缓冲液的配制
    2 方法
        2.1 裂殖酵母菌株的构建
        2.2 裂殖酵母基因组的粗提取—硅酸锆珠破碎法
        2.3 裂殖酵母的转化
        2.4 质粒DNA的提取
        2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.6 质粒DNA的细菌转化
        2.7 常规PCR
        2.8 定点诱变PCR
        2.9 T-type构建质粒
        2.10 梯度稀释实验(Drop test)
        2.11 免疫印迹检测(Western blot)
        2.12 免疫共沉淀(Co-IP)
        2.13 MBP-Hsp90(TEV sites)大肠杆菌的诱导表达及纯化
        2.14 TEV体外酶切实验
        2.15 转盘激光共聚焦显微镜使用
        2.16 RT-PCR
第三章 实验结果和分析
    1 特异破坏近着丝粒区的HSP90导致基因沉默的严重缺陷
    2 Hsp90调控含有Argonaute蛋白的基因沉默复合物的组装
    3 Hsp90与RITS复合物存在相互作用
    4 Hsp90调控SHREC复合物的组装参与异染色质基因沉默
    5 Hsp90调控Shelterin复合物的组装参与亚端粒区异染色质基因沉默
    6 Hsp90影响Shelterin复合物招募CLRC和SHREC复合物到亚端粒异染色质区
    7 epe1⊿和mst2⊿缺失突变可以逆转swo1-26突变体中的基因沉默的缺陷
第四章 讨论
参考文献
致谢



本文编号：3899887