CRISPR/Cas9系统介导小鼠维生素D受体基因敲除研究

发布时间：2024-04-21 21:39

　　基因敲除或者敲入是研究基因功能最为有效的途径,在细胞或生物体基因组上进行高效、精确的编辑一直是限制该领域快速发展的瓶颈。传统的基于同源重组的基因打靶技术由于效率低、费用高等问题限制了其广泛应用。由于在特异位点引入双链DNA缺口(DSBs)可提高同源重组的效率,研究和开发能够在基因组特定位点进行切割的人工核酸酶就成为生物技术领域的关键问题。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)后可用于基因组高效编辑的第三代人工核酸酶。CRISPR/Cas9是RNA介导的核酸酶,能够通过替换sgRNA进行人为设计,实施靶位点特异性切割产生DSBs,激发细胞同源重组修复机制或者非同源末端连接修复机制,进而实现基因组的定点敲除、定点敲入和基因修饰。维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)是一种核转录因子,广泛存在于多种组织中,与活性维生素D3结合后被激活,通过调控靶基因的转录和刺激细胞内不同信号通路发挥着广泛的生物学作用。VDR主要功能是调节体内钙的平衡、抑制细胞增殖和刺激细胞成熟等,与许多疾病的发生有关,涉及皮肤、免疫系统、结肠、乳房和前列腺等多...

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 基因组定点编辑
    1.2 人工锌指核酸酶
        1.2.1 锌指蛋白的设计与组装
        1.2.2 FokI内切酶
        1.2.3 ZFN在基因组编辑中的应用
    1.3 转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENS）
        1.3.1TALE的结构与DNA识别
        1.3.2 TALENs的应用
        1.3.3 TALENs特异性与脱靶
    1.4 CRISPR/CAS9系统及应用
        1.4.1 CRISPR/Cas系统基因结构与类型
        1.4.2 CRISPR/Cas的适应性免疫机制
        1.4.3 CRISPR/Cas9基因组编辑机制
        1.4.4 CRISPR/Cas9的应用
        1.4.5 CRISPR/Cas9在基因组编辑中脱靶问题
    1.5 维生素D受体研究进展
        1.5.1 维生素D受体结构与功能
        1.5.2 VDR调控基因的表达
        1.5.3 VDR与细胞内蛋白因子的相互作用
    1.6 本研究的目的和意义
第二章 VDR基因CRISPR/CAS9打靶系统构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 引物序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 维生素D受体基因（VDR）CRISPR/Cas9打靶位点的选择
        2.2.2 CRISPR/Cas9表达载体的构建
        2.2.3 报告载体的设计与构建
        2.2.4 CRISPR/Cas9活性与报告载体效果验证
    2.3 实验结果
        2.3.1 CRISPR/Cas9表达载体的鉴定
        2.3.2 CRISPR/Cas9报告载体的鉴定
        2.3.3 CRISPR/Cas9活性与报告载体效果
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 CRISPR/CAS9介导VDR基因编辑
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞株和质粒
        3.1.2 试剂和培养基的配制
        3.1.3 PCR引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞转染与筛选
        3.2.2 细胞基因组DNA提取与PCR扩增
        3.2.3 T7E1酶切检测
        3.2.4 TA克隆与测序
        3.2.5 数字PCR检测大片段删除及效率
    3.3 实验结果
        3.3.1 CRISPR/Cas9靶向编辑人VDR基因的效率
        3.3.2 CRISPR/Cas9靶向编辑小鼠VDR基因的效率
        3.3.3 CRISPR/Cas9介导VDR基因大片段删除
        3.3.4 细胞水平的脱靶效应
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 VDR基因敲除小鼠模型的构建
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物
        4.1.2 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录
        4.2.2 超数排卵与受精卵的提取
        4.2.3 假孕受体母鼠的准备
        4.2.4 显微注射
        4.2.5 受精卵的鉴定与移植
        4.2.6 F0代的鉴定与靶位点突变分析
        4.2.7 F0代VDR敲除鼠脱靶效应检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 F0代小鼠生产与靶位点PCR扩增
        4.3.2 F0代小鼠的T7E1检测
        4.3.3 F0代小鼠靶位点PCR产物测序检测
        4.3.4 F0代VDR基因敲除鼠脱靶突变检测
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 VDR基因敲除鼠表型鉴定及相关基因表达分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验动物
        5.1.2 实验试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 VDR基因敲除鼠和野生型小鼠总RNA提取
        5.2.2 定量PCR检测VDR及其相关基因的表达
        5.2.3 免疫荧光检测VDR在不同组织的表达差异
        5.2.4 表性分析
    5.3 实验结果
        5.3.1 敲除鼠和野生型小鼠VDR基因表达差异
        5.3.2 敲除鼠和野生型小鼠VDR相关基因表达分析
        5.3.3 敲除鼠表型分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章 慢病毒注射睾丸生产转CAS9基因小鼠
    6.1 实验材料
        6.1.1 实验动物
        6.1.2 细胞系与菌株
        6.1.3 病毒载体与病毒
        6.1.4 实验试剂
    6.2 实验方法
        6.2.1 慢病毒质粒的制备
        6.2.2 慢病毒包装与滴度测定
        6.2.3 慢病毒注射小鼠睾丸
        6.2.4 注射后小鼠睾丸组织免疫组化分析
        6.2.5 F0代配种与F1代检测与分析
    6.3 实验结果
        6.3.1 慢病毒滴度检测
        6.3.2 小鼠睾丸组织免疫组化检测
        6.3.3 F1代小鼠的PCR检测
    6.4 讨论
    6.5 小结
结论
创新点
后续研究
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介



本文编号：3961486