细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化

发布时间：2024-05-09 20:35

　　[目的]探究Lp PEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到p QE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出Lp PEX5基因,构建p QE-Lp PEX5原核表达载体并且诱导和纯化出Lp PEX5蛋白。[结论]Lp PEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析Lp PEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。

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【部分图文】：

图1LpPEX5-TPCR检测

菌落活化后，对诱导时间:0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h;诱导温度:20℃、25℃、30℃、37℃;IPTG浓度:0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L等进行探索，以寻找重组蛋白的最佳诱导条件....

图2LpPEX5与其他同源蛋白的序列比较

包涵体蛋白的提取及重组蛋白的纯化参照文献[19]的方法，采用8mol/L尿素溶解包涵体，进行蛋白的变性和复性。向纯化柱中加入2mLGST纯化树脂，用无菌水清洗1次，再用PBS平衡。将复性后的蛋白上清液加入纯化柱，轻柔颠倒混匀，静置30min，过滤杂蛋白保存。用5mL....

图3LpPEX5保守结构域分析

ProtParam分析LpPEX5蛋白质的理化性质，分子式为C3686H5635N1035O1167S23，相对分子质量为83857.90Da，总平均亲水性为-0.531。图4进化树分析LpPEX5蛋白的亲缘关系

图4进化树分析LpPEX5蛋白的亲缘关系

图3LpPEX5保守结构域分析PSIPREDV4.0软件预测LpPEX5蛋白是由许多螺旋和卷曲结构构成的二级结构(图5A);SWISS-MODEL软件分析三级结构(图5B)。SMART软件得出LpPEX5含有3个TPR结构域(图5C)。

本文编号：3968539