应用CRISR-Cas9在红色糖多孢菌进行基因编辑重构生物合成基因簇的研究

发布时间：2024-05-15 04:08

　　红霉素A(Erythromycin A,ErA)是红色糖多孢菌在次级代谢过程中合成产生的一类大环内酯类抗生素,具有日益增长的临床应用需求。因此,利用基因工程技术改造宿主菌,获得高产菌株,提高其工业产量仍是其研究的重中之重。随着新型基因组编辑技术的发展,改造合成基因簇、调控基因表达等干扰策略越来越受到研究人员的重视。红色糖多孢菌属于高GC含量的放线菌,基于传统的同源双交换原理的基因编辑技术效率低、操作周期长,严重限制了红色糖多孢菌基因改造的进程。对于红霉素A等次级代谢产物产量的提高则需要一种更为高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9系统广泛应用于许多物种的基因编辑,在放线菌属的天蓝色链霉菌中已经有基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,但是红色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9编辑工具。本研究应用CRISPR-Cas9高效基因编辑系统对红色糖多孢菌进行基因工程改造,包括敲入组成型强启动子、定点整合增加前体合成的酶,CRISPRi优化代谢流,构建并筛选得到红霉素A高产工业菌株。本研究率先开发了应用于红色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因编辑技术。主要研究内容如下:应用CRI...

【文章页数】：172 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１．１通过双链断裂进行基因编辑｜ｉｅ｜??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｇｅｎｏｍｅ?Ｅｄｉｔｉｎｇ?Ｕｓｉｎｇ?Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ?Ｂｒｅａｋｓ??（Ａ）?Ａ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ?ａ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＤＳＢ?ｉｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ．?（Ｂ）?ＺＦＮｓ，??

发成一种高效的基因编辑工具。其??中ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统是研宄最深入，应用最成熟的一种类别，目前为第三代基因??组定点编辑技术［４’５１。与前两代的ＺＦＮ?（Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ，锌指核酸酶）＊］和??ＴＡＬＥＮ?（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖ....

图１．６聚酮生物合成基因簇Ｉ１２３！??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｇｅｎｅ?Ｃｌｕｓｔｅｒｓ?ｆｏｒ?Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??ａｂｃ＼?ＡＢＣ?

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图１．７?ＤＥＢＳ模块的氨基酸序列比对序列｜１３２?

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图１．９?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ生物合成途径Ｉ１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．９?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ??

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本文编号：3973882