纳豆激酶热稳定性的突变及其在基因工程菌中的表达

发布时间：2024-11-29 22:18

　　在发酵纳豆类食物的过程中,纳豆发酵菌能够生产出一种碱性丝氨酸蛋白酶,即纳豆激酶(Nattokinase,NK)。纳豆激酶能够有效的溶解纤维蛋白(人体内血栓的主要成分),其作为一种新型溶栓类药物或者保健食品,与同类尿激酶等产品相比具有着生产原料价格低廉、安全性高等优势,具有广阔的市场前景。在纳豆激酶工业生产过程中,由于蛋白质分子的结构的破坏会出现热损耗高、酶活性低等现象。通过分子生物学手段,对纳豆激酶进行改造以提高其热稳定性和酶活性,以获得适应纳豆激酶大规模工业化生产的基因工程菌。本实验选择使用pET-26b原核表达载体,分别构建了含有纳豆激酶成熟肽、前导肽+成熟肽的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21中。在经过IPTG诱导表达后,离心收集菌体,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达。纤维蛋白板法检测表达蛋白的酶活。结果显示,纳豆激酶成熟肽及前导肽+成熟肽在大肠杆菌中均可成功表达;成熟肽表达的上清液和沉淀,均未表现出纤溶活性;前导肽+成熟肽表达的上清液表现出纤溶活性,而沉淀未表现出纤溶活性。通过文献阅读和生物信息学预测,筛选出166位甘氨酸,xxx(具体位点涉及保密内容,暂不公布...

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图0-1纳豆激酶溶栓机制

图0-1纳豆激酶溶栓机制丝氨酸蛋白酶类对血栓有着出众的溶解能力，能够灵敏的感知并结合到交状态下的纤维蛋白原[13]。纳豆激酶作为该蛋白家族中的一员，是在已知的近0种溶栓物中最具潜力的溶解纤维蛋白酶[14]。近年来，研究人员对纳豆激酶的

图1-1NKm片段PCR结果

一章纳豆激酶的原核表达）中加入150BP单位的牛P/ml；凝血酶溶液加入到1%的速混匀后倒入直径为9cmμl样品，37℃放置18h后的PCR扩增结果

图1-2NKm片段PCR结果

图1-2NKm片段PCR结果L2000；0：阴性对照；1、NKm片段，大小分

图1-3pET-26b-NKt菌落PCR结果

图1-3pET-26b-NKt菌落PCR结果：DNAMarkerDL2000；0：阴性对照；1-9：菌落PCR产物

本文编号：4012932