RBSDV P7-2基因重组AcMNPV及其生物学研究
发布时间：2024-12-18 02:08
本研究将具有诱导细胞凋亡功能的水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus,RBSDV）P7-2基因重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）的基因组中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。将带有SV40终止子的AcMNPV多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的P7-2基因依次插入到供体质粒pFastBac-HTB的多克隆位点处,使用供体质粒pFastBac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid bMON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测了P7-2基因的表达。在细胞水平上观察了两种病毒的多角体形成和统计了不同时间死亡细胞数量。通过病毒生长曲线和DNA复制曲线的测定,对比研究了两种病毒的增殖和DNA复制差异。将重组病毒Ac-P7-2和野生型病毒Ac-...
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1.1 杆状病毒的概况
1.1.1 杆状病毒简介
1.1.2 杆状病毒基因组的研究概况
1.1.3 杆状病毒的生物学
1.1.4 杆状病毒的生活史
1.1.5 杆状病毒在细胞中的增殖
1.2 杆状病毒的应用
1.2.1 用于外源基因的真核表达
1.2.2 杆状病毒用于基因治疗
1.2.3 杆状病毒作为生物杀虫剂
1.3 重组杆状病毒杀虫剂的研究进展
1.4 研究设想
第二章 重组病毒Ac-P7-2的构建
2.1 实验材料
2.1.1 载体、菌株及细胞系
2.1.2 生化试剂及细胞培养基
2.1.3 常规试剂的配制
2.1.4 实验所用引物
2.2 方法
2.2.1 聚合酶链式反应
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳分析
2.2.3 目的片段DNA分离回收
2.2.4 连接反应
2.2.5 限制性内切酶酶切反应
2.2.6 氯化钙感受态细胞的制备
2.2.7 质粒DNA的转化
2.2.8 碱裂解法提取质粒
2.2.9 目的基因的转座
2.2.10 BacmidDNA提取
2.2.11 重组Bacmid的转染
2.2.12 蛋白免疫印迹杂交(Westernblot)
2.2.13 供体质粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的构建
2.2.14 重组BacmidAc-P7-2的构建
2.2.15 P7-2蛋白表达的鉴定
2.2.16 实验技术路线
2.3 结果与分析
2.3.1 供体质粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的构建
2.3.2 重组bacmidAc-P7-2的构建
2.3.3 P7-2蛋白表达的鉴定
2.4 小结
第三章 Ac-P7-2的生物学特性研究
3.1 实验材料
3.2 方法
3.2.1 重组bacmidAc-P7-2转染sf9细胞的光学显微观察与细胞死亡时间分析
3.2.2 从感染病毒的细胞中提取病毒基因组
3.2.3 标准品T-GP41的构建
3.2.4 病毒DNA复制曲线的测定
3.2.5 病毒生长曲线的测定
3.2.6 BV的大量制备
3.2.7 多角体的扩繁
3.2.8 生物测定
3.2.9 技术路线图
3.3 结果与分析
3.3.1 Ac-P7-2转染sf9细胞的光学显微观察及细胞死亡时间分析
3.3.2 标准品T-GP41的构建
3.3.3 Ac-P7-2的复制曲线
3.3.4 Ac-P7-2的生长曲线
3.3.5 重组病毒LD50、LD90的测定
3.3.6 重组病毒LT50、LT90的测定
3.4 小结
第四章 结论
第五章 讨论
参考文献
附录 本文所用溶液配方
缩略词
致谢
作者简介
本文编号：4016881
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1.1 杆状病毒的概况
1.1.1 杆状病毒简介
1.1.2 杆状病毒基因组的研究概况
1.1.3 杆状病毒的生物学
1.1.4 杆状病毒的生活史
1.1.5 杆状病毒在细胞中的增殖
1.2 杆状病毒的应用
1.2.1 用于外源基因的真核表达
1.2.2 杆状病毒用于基因治疗
1.2.3 杆状病毒作为生物杀虫剂
1.3 重组杆状病毒杀虫剂的研究进展
1.4 研究设想
第二章 重组病毒Ac-P7-2的构建
2.1 实验材料
2.1.1 载体、菌株及细胞系
2.1.2 生化试剂及细胞培养基
2.1.3 常规试剂的配制
2.1.4 实验所用引物
2.2 方法
2.2.1 聚合酶链式反应
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳分析
2.2.3 目的片段DNA分离回收
2.2.4 连接反应
2.2.5 限制性内切酶酶切反应
2.2.6 氯化钙感受态细胞的制备
2.2.7 质粒DNA的转化
2.2.8 碱裂解法提取质粒
2.2.9 目的基因的转座
2.2.10 BacmidDNA提取
2.2.11 重组Bacmid的转染
2.2.12 蛋白免疫印迹杂交(Westernblot)
2.2.13 供体质粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的构建
2.2.14 重组BacmidAc-P7-2的构建
2.2.15 P7-2蛋白表达的鉴定
2.2.16 实验技术路线
2.3 结果与分析
2.3.1 供体质粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的构建
2.3.2 重组bacmidAc-P7-2的构建
2.3.3 P7-2蛋白表达的鉴定
2.4 小结
第三章 Ac-P7-2的生物学特性研究
3.1 实验材料
3.2 方法
3.2.1 重组bacmidAc-P7-2转染sf9细胞的光学显微观察与细胞死亡时间分析
3.2.2 从感染病毒的细胞中提取病毒基因组
3.2.3 标准品T-GP41的构建
3.2.4 病毒DNA复制曲线的测定
3.2.5 病毒生长曲线的测定
3.2.6 BV的大量制备
3.2.7 多角体的扩繁
3.2.8 生物测定
3.2.9 技术路线图
3.3 结果与分析
3.3.1 Ac-P7-2转染sf9细胞的光学显微观察及细胞死亡时间分析
3.3.2 标准品T-GP41的构建
3.3.3 Ac-P7-2的复制曲线
3.3.4 Ac-P7-2的生长曲线
3.3.5 重组病毒LD50、LD90的测定
3.3.6 重组病毒LT50、LT90的测定
3.4 小结
第四章 结论
第五章 讨论
参考文献
附录 本文所用溶液配方
缩略词
致谢
作者简介
本文编号：4016881
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