观赏羽衣甘蓝BoDFR基因的克隆及表达分析

发布时间：2025-01-20 13:11

　　 为揭示羽衣甘蓝二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因调控花青素合成的功能,该研究对不同叶色羽衣甘蓝的叶片花青素含量进行测定,根据结球甘蓝DFR序列信息,利用RT-PCR技术克隆羽衣甘蓝BoDFR基因并进行实时荧光定量表达分析。结果表明:BoDFR的cDNA全长为1 158 bp,编码385个氨基酸,其蛋白相对分子质量为42 925.06 Da,预测亚细胞定位为细胞质;蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲为DFR蛋白的主要二级结构元件。序列比对显示DFR蛋白具有NADPH结合位点和底物结合位点,属于NADB-Rossmann超基因家族。系统进化分析表明,BoDFR与结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)DFR亲缘关系最近。花青素含量测定显示,紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素含量最高,粉叶羽衣甘蓝含量较高,而白叶羽衣甘蓝叶片中检测不到花青素。实时荧光定量PCR分析表明,BoDFR基因表达量与花青素含量高低一致,其中紫叶羽衣甘蓝叶片中BoDFR基因的表达量最高,而白叶羽衣甘蓝心叶中仅微量表达。

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【部分图文】：

图1 不同叶色羽衣甘蓝试材

花青素提取参考李果等[11]的方法。取0.3g样品用1%盐酸甲醇4℃提取24h,12000r·min-1离心15min,取上清液定容至10mL。将样品分别用25mmol·L-1氯化钾溶液(pH1.0)和400mmol·L-1醋酸钠溶液(pH4.5....

图2 不同试材心叶花青素含量

以羽衣甘蓝叶片cDNA为模板,扩增出一段约1000bp的片段(图3)。将该片段连接pEASY载体,转化大肠杆菌后,经测序获得该片段完整序列,命名为BoDFR。序列分析结果显示,紫叶羽衣甘蓝BoDFR基因编码区全长1158bp(图3),编码385个氨基酸,其蛋白....

图3 BoDFR扩增结果

通过Blast对克隆得到的BoDFR基因编码的氨基酸序列进行比对分析,结果表明,羽衣甘蓝DFR蛋白与结球甘蓝的相似性最高,达到99.48%;与其他十字花科植物,如大白菜、甘蓝型油菜、芥菜、萝卜、拟南芥、醉蝶花相似性在72.42%～98.44%;而与其他5种非同科作物的相似性为69....

图4 BoDFR 蛋白质二级结构预测

为了研究DFR基因在不同叶色羽衣甘蓝中的表达情况,提取紫色、粉色、白色3个不同颜色心叶品系叶片的总RNA,反转录获得cDNA,以之为模板,利用荧光定量PCR检测BoDFR在不同叶色羽衣甘蓝心叶的表达模式(图7)。结果表明,BoDFR在3个试材心叶中均有表达,在紫色羽衣甘蓝心....

本文编号：4029302