重组副溶血弧菌过氧化氢酶catVPF1，catVPR2的克隆表达及基因功能研究

发布时间：2017-05-30 16:06

  本文关键词：重组副溶血弧菌过氧化氢酶catVPF1，catVPR2的克隆表达及基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种革兰氏阴性嗜盐短菌,广泛分布于海水、泥沙及海产品体内,是近年来人类食用海产品后引起的肠道疾病的主要原因之一,其致病性已引起世界性的广泛关注,对其致病机理的研究也越来越深入。过氧化氢酶(hydrogen peroxidase)又称触酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端抗氧化酶。过氧化氢酶常被广泛用于医学诊断、临床分析、食品消毒、以及造纸、纺织、制浆等工业。本课题来源于在副溶血弧菌VP110基因组中发现过氧化氢酶(catVPF1)及同工酶(catVPR2)。为研究这两种过氧化氢酶的活性以及过氧化氢酶在VP110体内的作用,利用原核表达系统表达目的蛋白后通过试剂盒检测目的蛋白的比酶活,同时利用over-lap PCR方法设计敲除过氧化氢酶基因,观察各表型菌株的抗氧化能力以及生长状况。利用RT-PCR实验方法检测在过氧化氢的培养基中过氧化氢酶基因表达量的变化。实验结果表明,副溶血弧菌过氧化氢酶在大肠杆菌中能有效表达,catVPF1测定结果为242.02 IU/mg,catVPR2测定结果为197.962 IU/mg。携带过氧化氢酶基因的副溶血弧菌菌株对氧化剂有一定抗性,经研究发现野生型菌株比过氧化氢酶基因缺失菌株抗氧化能力较强;单过氧化氢酶基因缺失菌株比双基因缺失菌株抗氧化能力强。RT-PCR检测结果显示在无氧环境下,随着过氧化氢浓度的增加过氧化氢酶基因表达总体下调;在有氧环境一定过氧化氢浓度下,过氧化氢酶基因表达量会随着过氧化氢的浓度升高而表达上调。当过氧化氢浓度过高时,过氧化氢酶基因表达受到抑制。综上所述,副溶血弧菌体内过氧化氢酶对菌的生长有一定的影响,可以使其在氧化环境中存活能力得到提高。
【关键词】：副溶血弧菌 过氧化氢酶 酶活力 基因敲除 RT-PCR
【学位授予单位】：湖北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S941.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 副溶血弧菌的研究进展10-13
• 1.1.1 副溶血弧菌的生长特性10-11
• 1.1.2 副溶血弧菌致病机理和主要毒力因子11-12
• 1.1.3 预防副溶血弧菌感染方法12
• 1.1.4 副溶血弧菌研究现状12-13
• 1.2 过氧化氢酶的研究进展13-14
• 1.2.1 过氧化氢酶的来源13-14
• 1.2.2 过氧化氢酶的应用14
• 1.3 本课题的研究目的和创新14-16
• 第二章 过氧化氢酶cat VPF1和cat VPR2的克隆和重组菌的构建16-26
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 菌株及培养条件16
• 2.1.2 质粒16-17
• 2.2 常用缓冲液17
• 2.3 分子试剂17-18
• 2.4 实验方法18-22
• 2.4.1 大肠杆菌质粒DNA的制备及提取18
• 2.4.2 细菌基因组DNA的制备18-19
• 2.4.3 质粒DNA的操作19
• 2.4.4 表达载体构建19-20
• 2.4.5 感受态细胞的制备与转化20-21
• 2.4.6 重组菌的筛选与鉴定21-22
• 2.4.7 菌种保藏与测序22
• 2.5 结果22-25
• 2.5.1 副溶血弧菌基因组的提取22-23
• 2.5.2 PCR扩增cat基因及纯化23-24
• 2.5.3 重组质粒载体的构建24
• 2.5.4 重组菌的鉴定结果24-25
• 2.5.5 菌种保藏测序25
• 2.6 讨论25-26
• 第三章 过氧化氢酶cat VPF1和cat VPR2的表达条件优化和活性测定26-37
• 3.1 常用试剂26
• 3.1.1 蛋白纯化缓冲液26
• 3.1.2 其他常用试剂26
• 3.2 蛋白诱导表达纯化及定量26-29
• 3.2.1 目的蛋白诱导表达26-27
• 3.2.2 目的蛋白纯化27
• 3.2.3 SDS-PAGE检测蛋白纯化效果27-28
• 3.2.4 蛋白含量的测定28-29
• 3.3 蛋白酶活力的测定29-30
• 3.4 实验结果30-35
• 3.4.1 SDS-PAGE电泳检测蛋白诱导及纯化效果30-31
• 3.4.2 蛋白浓度测定结果31-33
• 3.4.3 过氧化氢蛋白酶活测定33-34
• 3.4.4 蛋白表达条件优化结果34-35
• 3.5 讨论35-37
• 第四章 cat基因缺失菌株的构建与鉴定37-43
• 4.1 试验材料和方法37-40
• 4.1.1 试验材料37
• 4.1.2 目的基因敲除和回补37-38
• 4.1.3 缺失菌的构建38-39
• 4.1.4 回补菌的构建39-40
• 4.2 实验结果40-42
• 4.2.1 基因敲除与缺失菌株的构建40-41
• 4.2.2 缺失菌株的鉴定41-42
• 4.3 讨论42-43
• 第五章 野生型菌株与突变体菌株的生长特性研究43-52
• 5.1 基因缺失菌株的生长曲线测定43-45
• 5.1.1 材料与方法43
• 5.1.2 结果43-45
• 5.1.3 讨论45
• 5.2 各表型菌在氧化环境下生长特性研究45-48
• 5.2.1 滤纸片法测定各表型菌在过氧化氢存在下的抑菌圈45-46
• 5.2.2 各表型菌抑菌圈结果与分析46-48
• 5.3 各表型菌在不同过氧化物环境下生长状况探究48-51
• 5.3.1 各表型弧菌在高浓度过氧化氢环境中的生长状况48-49
• 5.3.2 各表型弧菌在高浓度异丙苯环境中的生长状况49-50
• 5.3.3 各表型弧菌在高浓度的叔丁基过氧化氢环境中生长状况50-51
• 5.4 结论与分析51-52
• 第六章 cat在氧化胁迫下对副溶血弧菌VP110基因的调控52-62
• 6.1 材料与方法52-53
• 6.1.1 试验材料52
• 6.1.2 细菌RNA提取和反转录52-53
• 6.2 有氧环境下cat在氧化胁迫下对基因表达的调控53-55
• 6.2.1 副溶血弧菌总RNA提取与定量53-54
• 6.2.2 基因组DNA的去除及c DNA的合成54
• 6.2.3 RT-PCR54-55
• 6.3 无氧环境下cat在氧化胁迫下对基因表达的调控55-56
• 6.3.1 无氧环境氧化胁迫下副溶血弧菌总RNA提取与定量55
• 6.3.2 基因组DNA的去除及c DNA的合成55-56
• 6.3.3 q PCR56
• 6.4 结果与分析56-62
• 6.4.1 有氧环境氧化胁迫下副溶血弧菌VP110总RNA的提取56-57
• 6.4.2 Real-Time PCR方法检测cat基因在有氧环境氧化胁迫下的转录水平57-59
• 6.4.3 无氧环境下副溶血弧菌VP110总RNA的提取59
• 6.4.4 Real-Time PCR方法检测cat基因在无氧环境下的转录水平59-62
• 第七章 总结与讨论62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-71
• 附录一 攻读硕士期间发表论文目录71-72
• 缩略语表72

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