柳枝稷Pvi-miR319基因及其靶基因PvPCF5的克隆与功能研究

发布时间：2017-05-30 18:04

  本文关键词：柳枝稷Pvi-miR319基因及其靶基因PvPCF5的克隆与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柳枝稷(Panicum virgatum L.)是一类暖季型的多年生草,最早生长在北美地区,属于禾本科黍属。近年来柳枝稷由于较高的产量,良好的生态效益,对贫瘠土壤广泛的适应性以及较高的纤维素含量等优良特征而受到高度的关注。大量的研究表明,miRN As及其靶基因在植物自身发育,营养平衡和多种多样的环境胁迫响应机制中扮演着至关重要的角色。然而,在模式能源植物柳枝稷中,miRN As的特性及其生物调控功能却鲜有报道。在本研究中,作者根据水稻的Osa-miR319a的茎环结构序列信息,克隆并鉴定了一个柳枝稷中的miR319基因即Pvi-miR319a。通过构建过表达载体转化水稻,成功获得并鉴定了21个Pvi-miR319a基因过量表达的阳性转基因水稻株系。与野生型水稻相比,大部分的转基因株系的叶片明显变宽,叶色变深,植株生长严重推迟,且两大叶脉间的小叶脉数量的平均值显著增加。此外,作者也克隆并鉴定了一个柳枝稷中的Pvi-miR319a的预测靶基因PvPCF5,该基因共编码444个氨基酸。经系统进化树及多重序列比对分析表明,该基因编码的蛋白PvPCF5属于TCP转录因子家族成员,并且在N端包含有一个保守的TCP结构域,其C端含有一段Pvi-miR319a的成熟序列互补区段。通过空间表达分析显示该基因在成熟穗中具有最高的表达量,而Pvi-miR319a则是在幼穗中的表达水平最高。之后根据烟草叶片的瞬时表达实验显示基因PvPCF5可以被Pvi-miR319a负调控表达,表明柳枝稷中的PvPCF5基因是Pvi-miR319a的一个靶基因。作者又通过转录激活及亚细胞定位实验对该基因进行功能验证,实验表明PvPCF5是一个具有转录激活活性的核定位蛋白,并且验证该蛋白的前段(1-299aa)起主要的转录激活作用。综上所述,我们推测Pvi-miR319a及其靶基因PvPCF5可能是一对重要的调节因子,主要参与植物叶片发育,营养生长等过程,在今后柳枝稷的遗传改良中将发挥更大的潜力。
【关键词】：柳枝稷 MiR319 TCP转录因子 叶片形态
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 缩略词6-11
• 1 引言11-24
• 1.1 柳枝稷的形态特征及应用11-12
• 1.2 MicroRNA研究进展12-14
• 1.2.1 MicroRNAs的发现12-13
• 1.2.2 MiRNAs在植物中的研究进展13-14
• 1.3 MiRNAs生物合成及作用机制14-16
• 1.3.1 MiRNA基因的转录和加工14
• 1.3.2 MiRNA进入到RNA诱导沉默复合体14
• 1.3.3 MiRNAs调控基因表达的方式14-15
• 1.3.4 MiRNAs靶基因及预测15-16
• 1.4 植物miRNAs的功能16-18
• 1.4.1 miRNAs参与调控植物的生长发育16-17
• 1.4.2 miRNAs参与调控植物胁迫应答机制17-18
• 1.5 MiRNA319研究进展18-21
• 1.5.1 MiR319靶基因的鉴定18-19
• 1.5.2 MiRNA319及靶基因的生物学功能19-21
• 1.6 研究内容及技术路线21-24
• 1.6.1 研究内容21-23
• 1.6.2 技术路线23-24
• 2 柳枝稷miRNA319基因的克隆与表达24-31
• 2.1 材料与试剂24
• 2.1.2 植物材料24
• 2.1.3 生物试剂24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 柳枝稷的培养方法24
• 2.2.2 总RNA提取及cDNA合成24-26
• 2.2.3 柳枝稷基因组DNA提取26
• 2.2.4 PCR扩增26-27
• 2.2.5 目的片段的测序27-28
• 2.2.6 Pvi-mi319基因的时空表达分析28
• 2.3 结果与分析28-30
• 2.3.1 Pvi-miR319a基因的同源克隆28-30
• 2.3.2 Pvi-miR319a的空间表达分析30
• 2.4 讨论30-31
• 3 柳枝稷Pvi-miR319a基因在水稻中的异位表达及表型分析31-41
• 3.1 植物材料31
• 3.2 实验方法31-34
• 3.2.1 过表达载体的构建31-33
• 3.2.2 转基因实验33-34
• 3.2.3 转基因水稻的鉴定34
• 3.3 结果与分析34-40
• 3.3.1 Pvi-miR319a过量表达转基因植株的鉴定34-38
• 3.3.2 过量表达Pvi-miR319a基因导致转基因水稻多种表型变化38-40
• 3.4 讨论40-41
• 4 Pvi-miR319a基因的靶基因预测及功能鉴定41-55
• 4.1 实验材料41
• 4.2 实验方法41-45
• 4.2.1 qRT-PCR分析预测靶基因的表达情况41-42
• 4.2.2 PvPCF5的时空表达分析42
• 4.2.3 烟草的瞬时表达实验42
• 4.2.4 PvPCF5的生物信息学分析42-43
• 4.2.5 质粒大提(选用Qiagen公司质粒大提试剂盒)43
• 4.2.6 亚细胞定位实验43-44
• 4.2.7 转录激活实验44-45
• 4.3 结果与分析45-54
• 4.3.1 转基因植株中Pvi-miR319a预测靶基因的表达分析45-46
• 4.3.2 PvPCF5基因的鉴定及表达模式分析46-48
• 4.3.3 烟草瞬时表达证明PvPCF5是Pvi-miR319a的靶基因48-49
• 4.3.4 柳枝稷PvPCF5基因编码了一个TCP转录因子蛋白49-54
• 4.4 讨论54-55
• 5 结论与展望55-57
• 5.1 结论55
• 5.2 展望55-57
• 参考文献57-63
• 个人简介63-64
• 导师简介64-65
• 获得成果目录65-66
• 致谢66

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