重组Brazzein基因植物表达载体的构建及对人参果的遗传转化

发布时间：2017-06-01 10:23

  本文关键词：重组Brazzein基因植物表达载体的构建及对人参果的遗传转化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人参果(Solanum muricatum Ait.)属茄科茄属多年生草本植物,与番茄、马铃薯等植物亲缘关系较近,其果实具高蛋白、低脂肪、低糖等特点,对高血压和糖尿病有食疗功效,是理想的营养保健水果之一。但人参果果实的风味过于清淡,味觉较差,甜度不足,致使其优越的营养保健功效易受人们的忽视,加之人参果以无性繁殖方式为主,存在严重的病毒病害,种质改良基础薄弱,进而导致人参果风味欠佳,品质变劣,产量下降。因此,利用基因工程技术,培育甜味高、抗性强、符合大众消费口味的人参果种质成为人参果栽培的迫切要求。本研究利用生物信息学方法,对茄科不同属植物的E8基因启动子亲缘关系及功能元件进行了分析,剖析了模式植物番茄果实特异性E8启动子与茄科其它属植物的亲缘进化关系;根据茄科植物密码子偏爱性,设计并合成了甜蛋白基因Brazzein,通过亚克隆E8启动子,分别构建由E8启动子及CaMV 35S启动子驱动的兼具重组甜蛋白及除草剂抗性基因的植物表达载体,完成人参果再生及遗传转化体系,为改善人参果种质和创新建立基础。研究取得的结果如下:1.对茄科不同种属及番茄的E8基因启动子亲缘关系及调控元件进行了分析,发现在茄科植物中E8基因启动子存在较高的保守性,包含ERE、茉莉酸和低温干旱应答等基序,说明番茄果实特异性E8启动子可用于特异性地改善同属植物人参果果实风味的生物技术改良研究。2.根据茄科植物密码子偏爱性设计并化学合成甜蛋白Brazzein基因,亚克隆了E8启动子基因,并利用2KGQ模型分析了Brazzein基因的空间结构特性。3.以pHANNIBAL及植物表达载体pCEPSP为基础载体,成功构建了分别由E8启动子和CaMV 35S启动子驱动的重组甜蛋白基因Brazzein兼具草甘膦抗性基因EPSPs植物表达载体,导入农杆菌得到了用于遗传转化的工程菌株。4.以人参果叶片为外植体,MS为基础培养基,通过优化激素组合,建立了人参果遗传转化体系,获得了转化再生植株54株,经PCR检测从中筛选出14株阳性植株,初步确定目的基因已整合到人参果基因组中。
【关键词】：人参果 重组甜蛋白Brazzein基因 E8启动子 草甘膦抗性基因EPSPs 植物表达载体 遗传转化
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S668.9
【目录】：

• 摘要4-5
• Summary5-7
• 缩略词表7-10
• Ⅰ引言10-11
• Ⅱ 文献综述11-22
• 1 人参果生产及研究概况11-13
• 1.1 人参果的生产现状11-12
• 1.2 人参果营养成分分析12-13
• 2 植物甜蛋白研究现状13-20
• 2.1 植物甜蛋白类型与研究进展13-17
• 2.2 甜蛋白Brazzein的研究进展17-20
• 3 植物启动子的研究进展20-22
• Ⅲ 研究的目的意义22-24
• Ⅳ 技术路线24-25
• Ⅴ 材料与方法25-48
• 1 材料25-26
• 1.1 菌种和质粒25
• 1.2 植物材料25
• 1.3 工具酶和试剂25
• 1.4 主要仪器设备25
• 1.5 培养基25-26
• 1.6 抗生素26
• 2 试验方法26-32
• 2.1 DNA的制备提取26-28
• 2.2 PCR产物及酶切产物的回收28-29
• 2.3 感受态的制备及转化29-32
• 3 基因克隆32-37
• 4 植物表达载体的构建37-44
• 4.1 中间载体pHAN-Bra-35S的构建39-40
• 4.2 植物表达载体pCEP-Bra-35S的构建40-42
• 4.3 植物表达载体pCEP-Bra-E8的构建42-44
• 5 遗传转化44-48
• 5.1 农杆菌工程菌获得及鉴定44-45
• 5.2 人参果外植体的转化与再生植株鉴定45-46
• 5.3 人参果转基因再生植株的DNA小量提取与PCR初步检测46-48
• Ⅵ 结果与分析48-64
• 1 果实特异性启动子E8基因的克隆与鉴定48-54
• 1.1 茄科不同种属植物的E8基因非编码区的生物信息学分析48
• 1.2 果实特异性启动子E8基因的克隆与鉴定48-54
• 2 甜蛋白Brazzein基因的克隆与鉴定54-57
• 2.1 甜蛋白Brazzein基因的克隆与鉴定54-56
• 2.2 甜蛋白Brazzein基因的结构分析56-57
• 3 植物表达载体的构建57-61
• 3.1 重组中间载体pHAN-Bra-35S的构建与鉴定57-58
• 3.2 重组植物表达载体pCEP-Bra-35S的构建与鉴定58-60
• 3.3 重组植物表达载体pCEP-Bra-E8的构建与鉴定60-61
• 4 遗传转化61-64
• 4.1 农杆菌工程菌的获得与鉴定61-62
• 4.2 人参果转基因再生植株的获得及初步鉴定62-64
• Ⅶ 讨论64-66
• Ⅷ 结论66-67
• 参考文献67-75
• 致谢75-77
• 导师简介77-79
• 作者简介79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：412394