耐盐基因SeNHX1在烟草中的表达研究

发布时间：2017-06-02 10:17

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【摘要】：SeNHX1基因是从盐生植物盐角草中(Saliconia europaea L.)克隆得到的液泡型Na+/H+逆向运输蛋白基因,其表达的Na+/H+逆向运输蛋白定位在液泡膜上。液泡型Na+/H+逆向运输蛋白可将细胞质中的Na+转运至液泡中,其在维持细胞质内离子平衡,调节细胞质酸碱度和维持细胞渗透压等方面发挥着重要作用。在前期研究工作中,利用农杆菌介导法对烟草进行耐盐基因SeNHX1转化,并获得了烟草转化植株。为了探讨耐盐基因SeNHX1在烟草中的表达规律,及其对转基因烟草耐盐性的影响,本论文研究课题以转SeNHX1基因烟草转化植株为材料,对其进行分子生物学鉴定,利用RT-PCR、实时荧光定量PCR对SeNHX1基因在转基因烟草中的表达及表达量进行测定,并对转SeNHX1烟草在盐胁迫下的生理生化特征进行检测和分析。主要研究结果如下:(1)对转SeNHX1基因烟草T0代转化植株进行PCR检测,结果显示SeNHX1基因成功转入烟草中,初步确定6株转SeNHX1基因烟草植株,分别为S1、S2、S3、S4、S5、S6;分别对以上转基因烟草植株T1代进行PCR检测,结果初步表明SeNHX1基因遗传到转基因烟草T1代中。(2)分别提取转SeNHX1基因烟草和非转基因烟草的RNA,反转录生成cDNA进行RT-PCR,凝胶电泳出现阳性条带,表明转基因烟草中SeNHX1基因在转录水平上表达,并进一步确定其为转基因植株。(3)利用实时荧光定量PCR对Se NHX1基因在转基因烟草中的表达量进行测定,SeNHX1基因在非转基因烟草和转基因烟草S1、S2、S3、S4、S5、S6中的表达量分别为:0%、20%、26.7%、14.29%、25%、12.5%、23.1%。(4)以NaCl为盐胁迫因子,胁迫浓度分别为0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L;检测非转基因和转SeNHX1基因烟草在不同盐胁迫浓度下的抗氧化酶活性、MDA和叶绿素含量的变化,结果如下:1)非转基因烟草和转SeNHX1基因烟草的SOD、APX、CAT、POD活性随盐浓度的升高而升高,转SeNHX1基因烟草抗氧化酶活性均高于同NaCl胁迫浓度的非转基因烟草。2)在无盐胁迫的处理条件下,转SeNHX1基因烟草和非转基因烟草的MDA含量差异不大,在盐胁迫下,所有烟草MDA含量随着NaCl浓度的升高而升高,所有转SeNHX1基因烟草植株的MDA含量均低于非转基因烟草。3)在盐胁迫下,转SeNHX1基因烟草和非转基因烟草的叶绿素含量均下降,并且与NaCl浓度呈负相关;在同NaCl胁迫浓度处理条件下,非转基因烟草叶绿素含量低于转SeNHX1烟草,并且随着NaCl浓度升高,下降明显。(5)将转SeNHX1基因烟草的T0代种子和非转基因烟草种子用次氯酸钠消毒后播种于含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上,2周后统计发芽率。结果如下:1)在0 mmol/L NaCl的处理条件下,非转基因烟草和转SeNHX1基因烟草种子的发芽率都接近100%;2)当NaCl浓度为50mmol/L、100 mmol/L时,所有烟草种子发芽率呈下降趋势,但非转基因相对转SeNHX1基因烟草下降幅度稍大;3)当NaCl浓度为150 mmol/L时,所有烟草种子发芽率大幅度下降,非转基因烟草种子下降显著;4)当NaCl浓度为200 mmol/L时,所有烟草种子发芽率降至最低,非转基因发芽率只有8%,转基因烟草发芽率在25%左右,其中S3转SeNHX1基因烟草植株发芽率最高。
【关键词】：转SeNHX1基因烟草 PCR RT-PCR 实时荧光定量PCR 抗氧化物酶活性 MDA含量 叶绿素含量 种子发芽率
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S572
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文献综述11-29
• 1.1 盐胁迫对植物造成的伤害12-15
• 1.1.1 渗透胁迫12
• 1.1.2 离子毒害12-13
• 1.1.3 次生胁迫效应13
• 1.1.4 破坏正常新陈代谢作用13-15
• 1.2 植物的耐盐机制15-21
• 1.2.1 形态耐盐15-16
• 1.2.2 渗透调节16-18
• 1.2.3 活性氧清除机制18-19
• 1.2.4 离子平衡19-21
• 1.3 Na~+/H~+ 逆向转运蛋白研究进展21-27
• 1.3.1 Na~+/H~+逆向转运蛋白的发现及细胞中定位21-22
• 1.3.2 Na~+/H~+逆向转运蛋白的结构22-24
• 1.3.3 Na~+/H~+逆向转运蛋白功能及作用机制24-27
• 1.3.4 Na~+/H~+逆向转运蛋白基因工程研究27
• 1.4 研究内容及目的27-29
• 第二章 耐盐基因SeNHX1在转基因烟草中的初步表达分析29-47
• 2.1 材料与方法29-31
• 2.1.1 植物材料29
• 2.1.2 大肠杆菌工程菌质粒29-30
• 2.1.3 主要试剂30
• 2.1.4 主要仪器设备30-31
• 2.2 方法31-38
• 2.2.1 植物材料的准备31
• 2.2.2 转SeNHX1基因烟草转化植株PCR检测31-33
• 2.2.3 转SeNHX1基因烟草的RNA提取33-35
• 2.2.4 烟草RNA浓度、纯度的检测35-36
• 2.2.5 烟草总RNA反转录36
• 2.2.6 转SeNHX1基因烟草RT-PCR检测36-37
• 2.2.7 转SeNHX1基因烟草的实时荧光定量PCR检测37-38
• 2.2.8 转SeNHX1基因烟草T_1代PCR鉴定38
• 2.3 结果与分析38-43
• 2.3.1 转SeNHX 1 基因烟草转化植株PCR电泳结果与分析38-39
• 2.3.2 烟草RNA提取质量检测结果39-40
• 2.3.3 转SeNHX 1 基因烟草RT- PCR电泳结果与分析40-41
• 2.3.4 转SeNHX1烟草中SeNHX1基因的表达结果与分析41-42
• 2.3.5 转SeNHX1基因烟草T_1代PCR结果与分析42-43
• 2.4 讨论43-47
• 2.4.1 不同植物NHX1基因生物的同源性分析43-44
• 2.4.2 SeNHX1基因在转基因烟草的表达量44
• 2.4.3 植物叶片总RNA的提取优化44-45
• 2.4.4 关于RT-PCR反应体系的优化45
• 2.4.5 实时荧光定量PCR的问题及优化方案45-47
• 第三章 转SeNHX1基因烟草耐盐性分析47-63
• 3.1 材料47
• 3.1.1 植物材料47
• 3.1.2 主要试剂47
• 3.1.3 主要仪器设备47
• 3.2 方法47-53
• 3.2.1 转SeNHX1基因烟草T_0代耐盐性胁迫处理47-48
• 3.2.2 转基因烟草SOD活性测定48-49
• 3.2.3 转基因烟草APX活性测定49-50
• 3.2.4 转基因烟草CAT活性测定50
• 3.2.5 转基因烟草POD活性测定50-51
• 3.2.6 转基因烟草MDA含量测定51-52
• 3.2.7 转基因烟草叶绿素含量测定52
• 3.2.8 转SeNHX1基因烟草种子在不同NaCl浓度下的发芽率检测52-53
• 3.3 结果与分析53-59
• 3.3.1 转基因烟草SOD活性测定结果与分析53-54
• 3.3.2 转基因烟草APX活性测定结果与分析54
• 3.3.3 转基因烟草CAT活性测定结果与分析54-55
• 3.3.4 转基因烟草POD活性测定结果与分析55-56
• 3.3.5 转基因烟草MDA含量测定结果与分析56-57
• 3.3.6 转基因烟草叶绿素含量测定结果与分析57-59
• 3.3.7 转基因烟草种子在不同NaCl浓度下的发芽率统计结果与分析59
• 3.4 讨论59-63
• 3.4.1 Na~+/H~+ 逆向转运蛋白在盐胁迫下的作用机理59-60
• 3.4.2 SeNHX1基因在烟草中的表达与盐胁迫下生理生化变化的关系60-63
• 第四章 全文讨论与结论63-67
• 4.1 转SeNHX1基因烟草转化植株分子生物学鉴定63
• 4.2 SeNHX1在转基因烟草中的表达63
• 4.3 转SeNHX1基因烟草T_0代在盐胁迫下生理生化变化63-65
• 4.4 耐盐基因SeNHX1对转基因烟草T_0代种子在盐胁迫下发芽率的影响65
• 4.5 SeNHX1基因表达与转基因烟草耐盐性关系65-66
• 4.6 下一步研究工作的设想66-67
• 参考文献67-75
• 致谢75

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