β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表达研究

发布时间：2017-06-07 12:13

  本文关键词：β-葡葡糖苷酶基因的克隆及表达研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,可利用纤维素酶将其水解为葡萄糖、寡糖及多种活性苷元。其水解产物可应用到多种工业生产中,如纺织业、造纸业、食品业、动物饲料、燃料、化学工业、制药工业等领域。p-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖,是整个纤维素水解反应的限速酶,它决定着纤维素酶整体活力的高低。本论文从提高黑曲霉β-葡萄糖苷酶表达量与酶活力的角度出发,通过RT-PCR及PCR技术分别获得了2583 bp的黑曲霉p-葡萄糖苷酶基因cDNA序列及2934 bp的DNA序列。将其cDNA序列分别克隆到pET28a、pET32a、pPIC9K载体上,分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行了异源表达；将其DNA序列克隆到pPICZaA载体上于毕赤酵母中进行了异源表达。将该p-葡萄糖苷酶基因于不同载体及不同宿主菌中表达得出：β-葡萄糖苷酶基因在原核中表达量较高,但其表达产物没有p-葡萄糖苷酶水解活性。分析pET28a载体重组子表达产物可能为包涵体,对其进行包涵体变性与复性处理,仍未检测到β-葡萄糖苷酶水解活性。pPIC9K重组载体转化毕赤酵母GS115,通过MD及MM平板鉴定其表型为Muts型。该重组毕赤酵母经甲醇诱导表达,采用七叶苷及pNPG法检测其诱导产物p-葡萄糖苷酶活性,结果表明,该重组子诱导产物具有一定的β-葡萄糖苷酶水解活性,但酶活较低。pPICZaA重组载体转化毕赤酵母GS115,采用PCR技术鉴定其表型为Mut+型。重组子经甲醇诱导表达,粗酶液采用pNPG法检测其β-葡萄糖苷酶活性,结果表明,该p-葡萄糖苷酶在30℃,pH 6.0时相对酶活最高,为0.274 U/mL。通过硫酸铵沉淀法及Ni-柱亲和层析法对p-葡萄糖苷酶进行了分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE检测结果表明,纯化之后的杂蛋白较多,需进一步探索。
【关键词】：黑曲霉 β-葡萄糖苷酶 克隆 表达
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q55
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-27
• 1 研究背景11-12
• 2 β-葡萄糖苷酶研究进展12-13
• 3 β-葡萄糖苷酶分离纯化13-14
• 3.1 硫酸铵沉淀法13
• 3.2 亲和层析法13
• 3.3 离子交换色谱法13-14
• 3.4 凝胶层析法14
• 3.5 疏水层析14
• 4 β-葡萄糖苷酶性质研究14-17
• 4.1 分子量14-15
• 4.2 温度15
• 4.3 pH15
• 4.4 底物特异性15-16
• 4.5 抑制剂16
• 4.6 激活因子16
• 4.7 动力学参数16-17
• 5 β-葡萄糖苷酶结构及功能研究17-18
• 6 β-葡萄糖苷酶催化反应机制18
• 7 β-葡萄糖苷酶活性检测18-19
• 7.1 pNPG法18
• 7.2 荧光法18-19
• 7.3 DNS法19
• 7.4 京尼平苷法测酶活19
• 8 β-葡萄糖苷酶的应用19-22
• 8.1 β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用19
• 8.2 在食品工业中的应用19-20
• 8.3 水解京尼平苷20
• 8.4 在农业中的应用20-21
• 8.5 在医学领域的应用21
• 8.6 工业上生产燃料乙醇21
• 8.7 β-葡萄糖苷酶其他应用21-22
• 9 β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达研究22-24
• 9.1 β-葡萄糖苷酶在原核系统中的表达22-23
• 9.2 β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达23-24
• 10 本课题研究的目的意义24-26
• 11 研究内容与技术路线26-27
• 第二章 材料和方法27-57
• 1 主要仪器设备27-28
• 2 实验材料、试剂及培养基28-29
• 2.1 供试菌株与质粒28
• 2.2 试剂与酶28-29
• 2.3 培养基与贮备液29
• 3 培养方法29
• 3.1 黑曲霉培养29
• 3.2 大肠杆菌培养29
• 3.3 毕赤酵母GS115培养29
• 4 试验方法29-57
• 4.1 RNAiso Plus提取黑曲霉总RNA29-30
• 4.2 2×CTAB法提取黑曲霉基因组30-31
• 4.3 β-葡萄糖苷酶基因引物设计31-32
• 4.4 RT-PCR获得β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列32-33
• 4.5 PCR获得β-葡萄糖苷酶基因DNA序列33
• 4.6 目的基因转化大肠杆菌Trans1-T133-36
• 4.7 酶切鉴定阳性重组子36-37
• 4.8 目的基因测序验证与分析37
• 4.9 重组pET28a表达载体的构建37-40
• 4.10 重组pET32a表达载体的构建40-42
• 4.11 重组pPIC9K表达载体的构建42-44
• 4.12 重组pPICZaA表达载体的构建44-49
• 4.13 重组表达载体pET28a及pET32a转化大肠杆菌BL21(DE3)49
• 4.14 重组表达载体pPIC9K及pPICZαA转化毕赤酵母GS11549-51
• 4.15 GS115重组子的筛选及表型鉴定51-52
• 4.16 重组子BL21(DE3)的诱导表达及β-葡萄糖苷酶活性检测52-53
• 4.17 重组毕赤酵母GS115的诱导表达53
• 4.18 β-葡萄糖苷酶及其活性检测53-55
• 4.19 β-葡萄糖苷酶的分离纯化55-57
• 第三章 结果与分析57-74
• 1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆57-67
• 1.1 黑曲霉总RNA提取与RT-PCR57-58
• 1.2 黑曲霉基因组DNA提取及PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因58
• 1.3 目的基因转化大肠杆菌Trans1-T158-60
• 1.4 测序验证与分析60-62
• 1.5 重组表达载体pET28a及pET32a的构建62-65
• 1.6 重组表达载体pPIC9K及pPICZA的构建65-66
• 1.7 毕赤酵母重组子筛选及表型验证66-67
• 2 重组BL21(DE3)的诱导表达及β-葡萄糖苷酶检测67-69
• 2.1 pNPG法检测β-葡萄糖苷酶活性67-68
• 2.2 七叶苷平板法检测β-葡萄糖苷酶活性68
• 2.3 SDS-PAGE检测表达产物68-69
• 3 重组毕赤酵母诱导表达及β-葡萄糖苷酶活性检测69-72
• 3.1 七叶苷法检测pPIC9K载体重组酵母诱导产物β-葡萄糖苷酶活性69-70
• 3.2 pNPG法检测pPICZaA载体重组酵母诱导产β-葡萄糖苷酶活性70-72
• 4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化72-74
• 4.1 硫酸铵沉淀法分离纯化β-葡萄糖苷酶72
• 4.2 Ni柱亲和层析72-74
• 结果与讨论74-76
• 展望76-77
• 附录77-83
• (一) 培养基与贮备液77-79
• (二) β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列79-80
• (三) β-葡萄糖苷酶基因氨基酸序列预测80-81
• (四) β-葡萄糖苷酶基因DNA序列81-83
• 参考文献83-95
• 致谢95

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