深红红螺菌CbbM基因的玉米叶绿体表达载体构建及表达分析

发布时间：2017-06-09 00:04

  本文关键词：深红红螺菌CbbM基因的玉米叶绿体表达载体构建及表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：玉米是全球第一大粮食作物,对人类的粮食安全起着至关重要的作用。由于可耕地面积的限制,玉米生产面临着提高单产水平的压力。从光合碳同化过程入手,探索提高玉米光合效率的机制是提高其单产水平的重要途径。Rubisco是Calvin循环的限速酶,其活性直接影响光合效率。本文从深红红螺菌中克隆Ⅱ型Rubisco大亚基基因,构建玉米叶绿体表达载体,为玉米维管束鞘细胞的异源Rubisco基因表达和分析CO2固定机制奠定基础,也为玉米光合作用的基因改造提供思路。主要结果如下：1.利用PCR法克隆的深红红螺菌Ⅱ型Rubisco大亚基基因(CbbM)编码序列含有1401个核苷酸,与玉米Rubisco大亚基的同源性为39.18%。2.利用PCR法克隆玉米叶绿体Rubisco大亚基(RbcL)的启动子和终止子,作为CbbM基因玉米表达的启动子和终止子,最终在pBluescriptⅡ KS(+)载体上将三者组装成重组基因。3.分析玉米叶绿体基因组序列,确定以叶绿体DNA的trnA和trnI片段作为CbbM重组基因插入玉米叶绿体DNA的同源重组序列。本研究从玉米全基因组提取物成功克隆到trnA和trnI片段,并分别连接到pMD19-T载体上。4.根据文献,确定aadA为标记基因,以玉米的16SrRNA基因启动子作为启动序列,以玉米RbcL的终止子作为终止序列。本研究从玉米全基因组提取物成功克隆到16SrRNA的启动子和RbcL的终止子,并分别成功连接到载体pMD19-T上。5.最后,通过构建中间载体,将CbbM重组基因和aadA标记基因成功连接到pBluescript Ⅱ KS(+)载体上,构建了CbbM基因的玉米叶绿体表达载体,并且成功在大肠杆菌中表达,其抗性得到初步验证。6.本研究还利用荧光定量PCR法对深红红螺菌CbbM基因表达进行了分析,结果表明：在20℃、25℃、30℃、35℃、40-C的条件下,CbbM基因在25℃时相对表达量最高；在黑暗、1000 lux、2000 lux、3000 lux、4000lux、 5000lux的光照强度下,CbbM基因在4000 lux下相对表达量最高；在培养基中氯化铵含量分别为0.5g/L、0.75g/L、 1g/L、1.25g/L、1.5 g/L的条件下,CbbM基因在1.25 g/L时表达量最高；在培养基中苹果酸含量分别为1g/L、2.5g/L、4 g/L、5.5g/L、7g/L的条件下,CbbM基因在4 g/L时相对表达量最高。
【关键词】：玉米 深红红螺菌 Rubisco CbbM 叶绿体表达载体
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513;Q943.2
【目录】：

• 摘要11-12
• Abstract12-13
• 第一章 文献综述13-22
• 1.1 Rubisco的研究进展13-16
• 1.1.1 Rubisco的分类和进化13-14
• 1.1.2 Rubisco的重组研究14-15
• 1.1.3 深红红螺菌Form Ⅱ Rubisco的研究进展15-16
• 1.2 叶绿体基因工程的研究进展16-20
• 1.2.1 叶绿体遗传转化的特点16-17
• 1.2.2 叶绿体基因工程的应用17-18
• 1.2.3 叶绿体遗传转化的方法18-19
• 1.2.4 叶绿体基因工程所需的标记基因和报告基因19-20
• 1.2.5 玉米叶绿体转化的研究进展20
• 1.3 研究的目的及思路20-22
• 第二章 深红红螺菌CbbM及玉米RbcL启动子和终止子的克隆22-44
• 2.1 材料与仪器22-23
• 2.1.1 材料22-23
• 2.1.2 仪器23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 深红红螺菌基因组DNA的提取23-24
• 2.2.2 CbbM基因的克隆24-27
• 2.2.3 CbbM基因的生物信息学分析及与玉米RbcL的比较27
• 2.2.4 玉米B73全基因组DNA的提取27-28
• 2.2.5 RbcL基因启动子的克隆28-29
• 2.2.6 RbcL基因终止子的克隆29
• 2.3 结果与分析29-42
• 2.3.1 深红红螺菌总DNA的提取结果29-30
• 2.3.2 CbbM基因片段克隆结果30-33
• 2.3.3 CbbM基因生物信息学分析及与玉米RbcL的比较33-37
• 2.3.4 玉米B73全基因组DNA提取结果37
• 2.3.5 RbcL基因启动子的克隆结果37-40
• 2.3.6 RbcL基因终止子的克隆结果40-42
• 2.4 讨论42-43
• 2.5 结论43-44
• 第三章 玉米叶绿体同源重组片段trnA、trnI基因的克隆44-53
• 3.1 材料与仪器44
• 3.1.1 材料44
• 3.1.2 仪器44
• 3.2 方法44-46
• 3.2.1 同源序列trnA基因的克隆44-45
• 3.2.2 同源序列trnI基因的克隆45-46
• 3.3 结果与分析46-51
• 3.3.1 同源序列trnA基因的克隆结果46-48
• 3.3.2 同源序列trnI基因的克隆结果48-51
• 3.4 讨论51
• 3.5 结论51-53
• 第四章 16SrRNA启动子、aadA标记基因和RbcL终止子的克隆53-64
• 4.1 材料与仪器53
• 4.1.1 材料53
• 4.1.2 仪器53
• 4.2 方法53-56
• 4.2.1 16SrRNA基因启动子的克隆53-54
• 4.2.2 aadA基因的克隆54-55
• 4.2.3 RbcL基因终止子的克隆55-56
• 4.3 结果与分析56-63
• 4.3.1 16SrRNA基因启动子的克隆结果56-58
• 4.3.2 aadA基因的克隆结果58-60
• 4.3.3 RbcL基因终止子的克隆结果60-63
• 4.4 讨论63
• 4.5 结论63-64
• 第五章 深红红螺菌CbbM基因玉米叶绿体表达载体的构建64-76
• 5.1 材料与仪器64-65
• 5.1.1 材料64-65
• 5.1.2 仪器65
• 5.2 方法65-66
• 5.2.1 中间载体pUC19-p的构建65
• 5.2.2 中间载体1302-a-T2-A的构建65
• 5.2.3 中间载体pBs Ⅱ KS-I-RP-M-T的构建65-66
• 5.2.4 CbbM叶绿体表达载体pBs Ⅱ KS-CbbM的构建及验证66
• 5.3 结果与分析66-75
• 5.3.1 中间载体pUC19-p的构建的结果66-67
• 5.3.2 中间载体1302-a-T2-A的构建的结果67-69
• 5.3.3 中间载体pBs Ⅱ KS-I-RP-M-T的构建的结果69-71
• 5.3.4 CbbM叶绿体表达载体pBs Ⅱ KS-CbbM的构建及验证71-72
• 5.3.5 CbbM叶绿体表达载体pBs Ⅱ KS-CbbM的构建总结72-75
• 5.4 讨论75
• 5.5 结论75-76
• 第六章 深红红螺菌CbbM基因表达分析76-85
• 6.1 材料与仪器76-77
• 6.1.1 材料76-77
• 6.1.2 菌种的活化及处理77
• 6.1.3 仪器77
• 6.2 方法77-79
• 6.2.1 引物设计77-78
• 6.2.2 深红红螺菌RNA的提取78
• 6.2.3 第一链cDNA合成78-79
• 6.2.4 实时荧光定量PCR79
• 6.3 结果与分析79-83
• 6.3.1 深红红螺菌总RNA提取和检测结果79-80
• 6.3.2 引物检测结果80
• 6.3.3 RT-PCR扩增产物鉴定结果80-81
• 6.3.4 CbbM基因实时定量PCR结果81-83
• 6.4 讨论83-84
• 6.5 结论84-85
• 参考文献85-92
• 致谢92

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