柱花草胶孢炭疽菌致病缺陷突变体的筛选及其相关基因的克隆

发布时间：2017-06-10 15:01

  本文关键词：柱花草胶孢炭疽菌致病缺陷突变体的筛选及其相关基因的克隆，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柱花草(Stylosanthes spp.),是全球热带地区栽培面积最大应用最广泛的优良豆科牧草。柱花草炭疽病(Stylo anthracnose)是柱花草生产上最严重的病害,该病主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。本研究在实验室已构建出的胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的基础上,筛选致病性缺陷突变菌株,通过Tail-PCR法克隆插入位点侧翼序列,利用生物信息学比对分析,研究T-DNA插入位点基因,利用Split Marker法构建基因敲除载体,验证基因功能,从分子水平上对病原菌致病基因进行克隆和功能分析,以研究其致病机理,希望能够对制定科学的炭疽病防治策略,培育持久性抗病柱花草品种,提供一定的分子基础及理论依据。(1)对本实验室构建的柱花草胶孢炭疽菌CH008 T-DNA插入突变体库筛选,获得致病缺陷突变体11株,包括致病性丧失突变体8株,为952、994、995、1171、1250、1338、1869、2508,致病性减弱突变体3株,为1681、1980、2638。PCR检测显示,T-DNA稳定插入到11株致病缺陷突变体菌株的基因组中；Southern印记杂交结果表明,菌株1250及2508为双拷贝,其余9株菌株均为单拷贝。(2)对致病缺陷突变体进行生物学性状分析,结果表明,突变菌株952、1980、2508与野生型CH008菌落形态具有差异性；突变菌株952、994、1338、1869、1980、2508生长速率明显降低；突变菌株1250、1338、1681、1869、1980、2508、2638产孢量显著减少；突变菌株952、995、1681、1980、2638孢子萌发率显著下降；突变菌株952、994、1171、1250、1681在应对NaCl盐胁迫时与野生型响应机制不同；突变菌株952、995在高渗透剂山梨醇胁迫下生长速率与野生型CH008存在明显差异；952、1869、1980、2638在添加细胞壁抑制剂的培养基上抑制率显著增大；菌株994、995、1250、1338、1869、1980、2638在金属离子胁迫下响应机制变化较大。(3)利用TAIL-PCR方法克隆各突变菌株插入位点的侧翼序列,通过生物信息学方法对T-DNA插入位点进行分析,对标记基因进行预测,结果表明,菌株952 T-DNA插入位点位于起始外显子区域,标记基因CgDps编码259个氨基酸,为DNA聚合酶α/δ/ε亚基；菌株994 T-DNA插入位点为基因末端外显子附件区域,标记基因CgAss编码556个氨基酸,属焦磷酸硫胺素家族,乙酰乳酸合成酶催化亚基；菌株995 T-DNA插入位点为基因转录起始位点附近区域,标记基因CgCgt编码444个氨基酸,为神经酰胺糖基转移酶；菌株1171 T-DNA插入位点为基因末端外显子附近区域,标记基因CgGgh编码114个氨基酸,为糖苷酸水解酶基因；菌株1250标记基因其中之一为CgGpp, T-DNA插入位点为基因末端外显子附近区域,基因编码314个氨基酸,为葡萄糖调节蛋白前体基因；菌株1338标记基因CgHpI编码155个氨基酸,为假定蛋白；菌株1681 T-DNA插入位点为起始外显子附近区域,基因CgPss编码682个氨基酸,为苯丙氨酰-tRNA合成酶p亚基；菌株1869 T-DNA插入位点位于转录起始位点启动子区域,标记基因CgPtr编码418个氨基酸,为pH应答转录调控因子基因；菌株2508标记基因其中之一为CgHp2,T-DNA插入位点为居间外显子区域,编码313个氨基酸,为假定蛋白；菌株2638 T-DNA插入位点位于转录起始位点启动子区域,标记基因CgNsp编码198个氨基酸,为NADP(H)结合蛋白(HSCARG).上述基因中,cgPtr与已知胶孢炭疽菌致病基因Pacl同源,其余9个基因的致病相关性,本文为首次报道,其中CgDps与CgNsp基因序列NCBI未能检索获得,为首次发现。(4)采用Split-marker方法对敲除载体进行构建,利用同源重组原理对柱花草炭疽菌突变菌株952和1869标记基因CgDps,CgPtr进行敲除,通过原生质体转化以及PCR分子检验,最终获得8株基因CgDps敲除突变体,5株基因CgPtr敲除突变体。对敲除突变体进行致病力测定,结果表明,8株基因CgDps基因敲除突变体中,6株突变体致病力丧失,2株致病力减弱；在5株基因CgPtr敲除突变体中,3株突变体致病力丧失,2株致病力减弱。对敲除突变体进行生物学性状分析,结果表明,基因CgDps和CgPtr与菌落的生长速率、产孢量、孢子萌发有关,参与盐胁迫响应机制；基因CgDps、CgPtr可能具有诱导机体某种机制以应对外界环境的金属离子胁迫的作用；基因CgDps参与高渗透剂胁迫响应机制；基因CgPtr具有诱导机体某种机制以应对外界环境的pH变化的作用。基本确定基因cgDps与CgPtr为致病相关基因,且CgDps为新的致病相关基因。
【关键词】：柱花草 炭疽菌 致病缺陷突变体 致病相关基因 CgDps CgPtr
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-22
• 1.1 柱花草11-12
• 1.2 柱花草炭疽病12-16
• 1.2.1 发生、分布与危害12
• 1.2.2 病原菌及生物学特性12-13
• 1.2.3 防治方法13-15
• 1.2.4 抗病机制及转抗病基因的研究15-16
• 1.3 柱花草炭疽菌分子生物学研究16-20
• 1.3.1 根癌农杆菌介导炭疽菌遗传转化16
• 1.3.2 T-DNA标记基因侧翼序列的研究16-17
• 1.3.3 基因敲除技术的研究17-19
• 1.3.4 胶孢炭疽菌致病相关基因的研究进展19-20
• 1.4 研究内容、目的及意义20-21
• 1.5 技术路线21-22
• 2 材料与方法22-39
• 2.1 试验材料22-26
• 2.1.1 菌株、质粒及植物材料22
• 2.1.2 试剂及抗生素22-24
• 2.1.3 仪器设备24
• 2.1.4 培养基24-25
• 2.1.5 引物25-26
• 2.2 试验方法26-39
• 2.2.1 柱花草胶孢炭疽菌致病缺陷突变体的筛选26
• 2.2.2 致病缺陷突变体分子检测26-30
• 2.2.3 致病缺陷突变体生物学性状分析30-32
• 2.2.4 致病缺陷突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆与分析32-34
• 2.2.5 致病缺陷突变体952、1869 T-DNA标记基因CgDps,CgPtr功能验证34-39
• 3 结果与分析39-91
• 3.1 炭疽菌致病缺陷突变体的筛选39-40
• 3.2 炭疽菌致病缺陷突变体的分子检测40-42
• 3.2.1 炭疽菌致病缺陷突变体T-DNA插入稳定性PCR检测40-41
• 3.2.2 炭疽菌致病缺陷突变体Southern印迹杂交验证41-42
• 3.3 炭疽菌致病缺陷突变体生物学性状分析42-56
• 3.3.1 致病缺陷突变体菌落形态及生长速率测定分析42-43
• 3.3.2 致病缺陷突变体产孢量及孢子形态分析43-45
• 3.3.3 致病缺陷突变体孢子萌发率的测定分析45-46
• 3.3.4 致病缺陷突变体NaCl盐胁迫分析46-49
• 3.3.5 致病缺陷突变体高渗透剂山梨醇(Sorbitol)胁迫分析49-51
• 3.3.6 致病缺陷突变体细胞壁敏感性分析51-53
• 3.3.7 致病缺陷突变体金属离子胁迫分析53-56
• 3.4 炭疽菌致病缺陷突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆与分析56-70
• 3.4.1 致病缺陷突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆56-57
• 3.4.2 致病缺陷突变体T-DNA插入位点标记基因的预测57-70
• 3.5 致病缺陷突变体952、1869 T-DNA标记基因CgDps、CgPtr功能验证70-91
• 3.5.1 敲除突变体载体的构建70-71
• 3.5.2 敲除突变体的获得71-73
• 3.5.3 敲除突变体的分子检测73-75
• 3.5.4 敲除突变体致病力的测定75-76
• 3.5.5 敲除突变体生物学性状分析76-91
• 4 讨论91-97
• 4.1 炭疽菌致病缺陷突变体的筛选91
• 4.2 炭疽菌致病缺陷突变体生物学性状分析91-92
• 4.3 炭疽菌致病缺陷突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆92
• 4.4 炭疽菌致病缺陷突变体T-DNA插入位点标记基因的分析92-95
• 4.5 基因CgDps、CgPtr功能验证95-97
• 5 结论97-100
• 6 研究展望100-101
• 参考文献101-114
• 基金项目资助114-115
• 攻读硕士期间发表的文章115-117
• 致谢117

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：438859