西瓜噬酸菌基因Aave-3192、Aave-2108和Aave-4679、Aave-2716的功能研究

发布时间：2017-06-10 15:17

  本文关键词：西瓜噬酸菌基因Aave-3192、Aave-2108和Aave-4679、Aave-2716的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：通过对本实验室构建的西瓜噬酸菌的Tn5插入突变体库进行筛选,从中获得2株致病性丧失、群体感应信号增强、胞外多糖的产量下降并丧失烟草过敏性反应的菌株,分别为166和167。进一步通过亚克隆技术,获得了这2株菌株的Tn5插入位置,其插入基因分别为Aave-3192和Aave-2108,这两个基因分别编码Hypothetical protein和Methyl-accepting chemotaxis sensory transducer。通过基因互补的方法构建插入突变菌株的互补菌株,互补菌株的生物学测定结果表明,互补菌株的致病能力恢复,游动性,群体感应能力,胞外多糖的产量,生物膜的形成能力等功能也部分恢复,证明这两个基因都与西瓜噬酸菌的致病性相关。已有研究表明,西瓜噬酸菌存在遗传分化,目前将西瓜噬酸菌分为两个亚群,这两个亚群的菌株在生物学特性方面存在较大的差异。本研究通过西瓜噬酸菌全基因组序列,设计16对菌毛基因引物,并进行PCR扩增,结果表明,有4对引物只能扩增出亚群Ⅱ菌株菌毛基因；于是,对其中的两个菌毛基因Aave-4679 (pilA)和Aave-2716 (pill)进行定点突变,探讨其功能,结果表明,菌毛基因pilA缺失后病菌的致病性下降,生物膜形成能力下降,游动性减弱,群体感应丧失,NA培养基上菌落形态发生变化,无菌裙产生,但有烟草过敏反应；而pill基因缺失后病菌的游动性下降,在NA培养基上菌落形态上较野生菌菌裙宽度变窄,而致病性、生物膜的形成能力等生物学特性与野生菌株一致。实验结果证明了pilA与西瓜噬酸菌的致病性有关,而pill与致病性无关。
【关键词】：西瓜噬酸菌 Tn5转座子 基因敲除 基因互补 菌毛基因
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.42
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 1 前言9-16
• 1.1 西瓜细菌性果斑病研究概况9-14
• 1.1.1 病原菌的生物学特征及分类地位10-11
• 1.1.2 病原检测研究进展11
• 1.1.3 致病机理研究进展11-13
• 1.1.4 遗传多样性研究13-14
• 1.2 本研究的目的意义14-16
• 2 致病相关基因Aave-3192和Aave-2108的功能研究16-37
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 供试菌株和质粒16
• 2.1.2 供试西瓜、甜瓜和烟草品种16
• 2.1.3 培养基16-17
• 2.1.4 抗生素及工作浓度17
• 2.1.5 试剂17
• 2.1.6 主要仪器17
• 2.1.7 引物17-18
• 2.2 实验方法18-24
• 2.2.1 西瓜噬酸菌特异性和Tn5转座子插入突变的PCR验证18-19
• 2.2.2 突变株的生物学测定19-20
• 2.2.3 亚克隆定位Tn5插入位点20-21
• 2.2.4 互补菌株构建21-23
• 2.2.5 互补菌株的生物学测定23-24
• 2.3 结果和分析24-35
• 2.3.1 西瓜噬酸菌特异性和Tn5转座子插入突变验证24-25
• 2.3.2 突变株的生物学测定25-27
• 2.3.3 亚克隆子验证27
• 2.3.4 亚克隆测序分析转座子插入位点27-28
• 2.3.5 互补载体的构建28-30
• 2.3.6 互补菌株的获得30-31
• 2.3.7 互补菌株的生物学测定31-35
• 2.4 小结和讨论35-37
• 3 西瓜噬酸菌菌毛特异基因的初探37-53
• 3.1 实验材料37-39
• 3.1.1 菌株和质粒37
• 3.1.2 试剂37
• 3.1.3 主要仪器37-38
• 3.1.4 引物38-39
• 3.2 实验方法39-43
• 3.2.1 菌株的培养39
• 3.2.2 西瓜噬酸菌基因组DNA及质粒的提取39
• 3.2.3 菌毛基因PCR扩增筛选39-40
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测40
• 3.2.5 构建自杀敲除载体40-42
• 3.2.6 基因的敲除及验证42
• 3.2.7 缺失菌株的生物学测定42-43
• 3.3 结果和分析43-51
• 3.3.1 菌毛特异性基因的琼脂糖凝胶电泳检测43-44
• 3.3.2 敲除载体的获得44-47
• 3.3.3 基因缺失菌株的获得47-48
• 3.3.4 缺失突变株的生物学测定48-51
• 3.4 小结与讨论51-53
• 4 结论与讨论53-54
• 参考文献54-59
• 附录Ⅰ 基因组DNA的提取步骤59
• 附录Ⅱ 质粒DNA提取步骤59-60
• 附录Ⅲ DNA回收纯化60
• 附录Ⅳ 转化60-61
• 致谢61

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