基于16SrRNA基因的食源性致病菌的实时荧光PCR检测研究

发布时间：2017-06-10 17:13

  本文关键词：基于16SrRNA基因的食源性致病菌的实时荧光PCR检测研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来食品安全事件频发使得食品安全已经成为了全民关注的共同话题。食品安全问题成为关系到各个层次的人的民生问题,而在各类食品安全事件中,由食源性致病菌引起的食物中毒是食品安全问题的主要方面。最常见的食源性致病菌有志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。目前国内对食源性致病菌的检测方法主要沿用传统的细菌分离培养鉴定法,其检测过程复杂琐碎,耗时太长,不仅灵敏度不高,且每次只能确定或排除一种病原菌,难以满足对食源性致病菌快速准确检测的需要。因此,建立一种多重、快速、高效的检测技术是十分必要的。本研究利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)这三种主要食源性致病菌的多重实时荧光PCR检测技术。利用16SrRNA基因作为靶基因设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针,引物和探针双重控制靶基因的选择,具有很好的特异性和灵敏度。研究结果:(1)选取细菌16SrRNA基因作为靶基因,设计PCR引物,以志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌三种菌为目标菌,六种菌为对照菌,通过普通PCR扩增及测序验证,该引物可以作为兼并引物用于进一步研究。(2)优化建立针对单一细菌基因检测的单一实时荧光定量PCR检测体系,在单一实时PCR检测体系的基础上进一步优化建立了三重实时荧光PCR检测体系。(3)实时荧光PCR体系特异性良好,只有目标菌株出现阳性扩增信号。(4)灵敏度高,基因组DNA灵敏度为10-4 ng。(5)成功构建质粒标准品,绘制了3株菌的标准曲线。研究结果表明,本课题建立的针对志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重实时荧光PCR方法,简便快捷,大大缩短了检测时间。在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景。
【关键词】：食源性致病菌 16SrRNA基因 多重实时荧光PCR TaqMan探针
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R155.3
【目录】：

• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 第一章 文献综述10-23
• 1 研究背景10-12
• 2 本文涉及的三种主要食源性致病菌的概述12-14
• 2.1 志贺氏菌12-13
• 2.2 金黄色葡萄球菌13
• 2.3 沙门氏菌13-14
• 3 食源性致病菌检测方法概况14-21
• 3.1 传统检测方法15
• 3.2 传统平板检测方法的改进15
• 3.3 免疫学方法15-18
• 3.4 仪器分析技术18-19
• 3.5 分子生物学方法19-21
• 4 16SrRNA基因在致病菌检测中的研究地位21-22
• 5 研究目的意义22
• 6 研究的主要内容22-23
• 第二章 三种食源性致病菌的定性PCR检测23-35
• 1 前言23
• 2 材料与方法23-27
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 菌株23
• 2.1.2 主要试剂23-24
• 2.1.3 仪器与设备24
• 2.1.4 培养基的配制24
• 2.1.5 溶液的配制24-25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 菌株的活化及培养25
• 2.2.2 细菌基因组的提取25
• 2.2.3 DNA浓度及纯度测定25-26
• 2.2.4 引物的设计与合成26
• 2.2.5 引物的处理26
• 2.2.7 兼并性检测26
• 2.2.8 灵敏度检测26-27
• 2.2.9 PCR产物纯化及测序分析27
• 3 结果与分析27-34
• 3.1 主要供试菌株菌落形态图27
• 3.2 细菌基因组提取27-28
• 3.3 DNA浓度及纯度测定结果28-29
• 3.4 定性PCR反应体系和条件的优化结果29-30
• 3.5 兼并性验证30-31
• 3.6 灵敏度验证31-32
• 3.7 PCR产物测序结果32-34
• 4 讨论34-35
• 第三章 三重实时荧光PCR检测35-51
• 1 前言35
• 2 材料与方法35-39
• 2.1 材料35-36
• 2.1.1 主要试剂35
• 2.1.2 仪器与设备35-36
• 2.1.3 生物信息学软件36
• 2.2 方法36-39
• 2.2.1 引物与探针的设计36-37
• 2.2.2 多重实时荧光PCR体系建立37-38
• 2.2.3 荧光定量PCR性能评价38-39
• 2.2.4 模拟样品试验39
• 3 结果与分析39-49
• 3.1 三种致病菌的序列比对结果39-40
• 3.2 多重实时荧光PCR体系建立结果40-42
• 3.2.1 单重实时荧光PCR反应体系的优化结果40-41
• 3.2.2 多重实时荧光PCR体系建立结果41-42
• 3.3 实时荧光PCR性能评价结果42-44
• 3.3.1 特异性42-43
• 3.3.2 三种致病菌的基因组DNA灵敏度扩增结果43-44
• 3.4 模拟样本检测结果44-49
• 3.4.1 菌液计数结果44-45
• 3.4.2 模拟水样的单重实时荧光PCR灵敏度结果45-46
• 3.4.3 模拟牛奶样品的单重实时荧光PCR灵敏度结果46-47
• 3.4.4 模拟样品的多重实时荧光PCR检测结果47-49
• 4 讨论49-51
• 第四章 三种致病菌阳性质粒分子的构建51-63
• 1 前言51
• 2 材料与方法51-55
• 2.1 材料51-52
• 2.1.1 主要试剂51
• 2.1.2 仪器与设备51
• 2.1.3 培养基与试剂配制51-52
• 2.1.4 生物信息学软件52
• 2.2 方法52-55
• 2.2.1 DNA的连接52
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞制备52-53
• 2.2.3 细菌转化过程53
• 2.2.4 蓝白斑筛选53
• 2.2.5 重组质粒验证53-54
• 2.2.6 单菌落活化及质粒提取54
• 2.2.7 质粒DNA定性PCR验证54
• 2.2.8 质粒的测序鉴定54
• 2.2.9 标准曲线的绘制54-55
• 3 结果与分析55-62
• 3.1 菌落PCR的初步鉴定结果55-56
• 3.2 质粒DNA定性PCR结果56-57
• 3.3 质粒的测序结果57-58
• 3.4 标准曲线的绘制结果58-62
• 4 讨论62-63
• 第五章 结论63-64
• 参考文献64-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李凡;许恒毅;李福来;;多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展[J];食品工业科技;2015年21期

2 布日额;任晓峰;吴金花;锡林高娃;王学理;刘燕;孙立杰;刘洋;;牛乳中致病性金黄色葡萄球菌快速检测胶体金免疫层析方法研究[J];中国预防兽医学报;2013年11期

3 洪炳财;陈向标;赖明河;;食品中微生物快速检测方法的研究进展[J];中国食物与营养;2013年05期

4 陈燕;刘杰;李玉兰;刘芳生;;食源性致病菌快速检测技术研究进展[J];安徽农业科学;2013年05期

5 庞璐;张哲;徐进;;2006—2010年我国食源性疾病暴发简介[J];中国食品卫生杂志;2011年06期

6 康静静;杨玉荣;梁宏德;;志贺氏菌病发病机制的研究进展[J];中国农业科学;2011年09期

7 索标;汪月霞;艾志录;;食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展[J];微生物学杂志;2010年06期

8 刘渠;廖灵灵;徐亚军;李涌;;荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A方法研究[J];中国卫生检验杂志;2010年04期

9 黄文宇;柳陈坚;;食源性沙门氏菌检测方法的研究进展[J];生物技术;2009年03期

10 任天红;刘景武;付素兰;;金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的应用及进展[J];河北医药;2008年08期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张超楠;食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[D];吉林大学;2012年

  本文关键词：基于16SrRNA基因的食源性致病菌的实时荧光PCR检测研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：439266