中间锦鸡儿黄酮合成相关基因的克隆和功能鉴定

发布时间：2017-06-10 22:03

  本文关键词：中间锦鸡儿黄酮合成相关基因的克隆和功能鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：黄酮类化合物是一类天然的次生代谢产物,具有抗氧化,防治骨质疏松,抗肿瘤等作用,现已得到广泛的研究。本研究通过RT-PCR以及RACE技术从中间锦鸡儿中克隆到了两个黄酮类化合物合成途径上的基因,分别是CiCHI(查尔酮异构酶)和CiFLS(黄酮醇合成酶),并构建了两个基因的植物表达载体,转化野生型拟南芥,结果如下：1、中间锦鸡儿CiCHI基因cDNA全长1005bp,ORF为678bp(111bp-788bp),5'-UTR长110bp,3'-UTR长217bp,编码226个氨基酸,推测的分子量为24.413KD,理论等电点为5.66,是一种稳定的两性蛋白；CiFL S基因全长为1844bp,ORF为 1020bp(568bp-1587bp),5'-UTR为567bp,3'-UTR为257bp,编码340个氨基酸,推测的分子量为38.765KD,是一种不稳定的疏水蛋白,理论等电点为6.01。2、利用实时荧光定量PCR检测了不同处理下中间锦鸡儿幼苗中这两个基因的表达情况以及二者在不同组织部位的表达情况。CiCHI基因受到紫外、NaCl的诱导,表达趋势是先上升后下降,而ABA处理后其表达是受到抑制的；CiFLS基因对这三种处理均没有响应。二者在中间锦鸡儿幼苗中表达最高的部位是叶,表达最低的部位是根。3、构建过表达载体p35S::CiCHI和p35S::CiFLS,并转化野生型拟南芥,得到纯合体株系。4、检测过表达植株当中总黄酮和花青素含量。过表达CiCHI基因的拟南芥中总黄酮含量高于野生型拟南芥,而花青素含量变化不大；过表达CiFLS基因的拟南芥体内的总黄酮及花青素含量没有明显变化。
【关键词】：中间锦鸡儿 CiCHI CiFLS 克隆 黄酮 花青素
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 缩略词表8-9
• 1 引言9-18
• 1.1 黄酮类化合物的基本概况9-10
• 1.1.1 黄酮类化合物的结构与分类9
• 1.1.2 黄酮类化合物的功能9-10
• 1.2 黄酮类化合物的合成路径10-11
• 1.3 查尔酮异构酶11-15
• 1.3.1 查尔酮异构酶的分离与分类11-12
• 1.3.2 CHI蛋白的结构与作用机制12-13
• 1.3.3 CHI基因的表达特性13-14
• 1.3.4 CHI的系统进化14
• 1.3.5 CHI转基因的应用14-15
• 1.4 黄酮醇合成酶15-17
• 1.4.1 黄酮醇合成酶的功能与分离15-16
• 1.4.2 FLS在植物中的表达及调控16
• 1.4.3 FLS转基因的应用16-17
• 1.5 中间锦鸡儿的概况17
• 1.6 研究目的及意义17-18
• 2 材料和方法18-27
• 2.1 试验材料18-20
• 2.1.1 植物材料18
• 2.1.2 菌株与质粒载体18
• 2.1.3 仪器与试剂18-19
• 2.1.4 引物合成与测序19-20
• 2.2 试验方法20-27
• 2.2.1 植物材料的培养20
• 2.2.2 培养基的配制20
• 2.2.3 中间锦鸡儿和拟南芥RNA提取及cDNA的获得20-21
• 2.2.4 感受态的制备和目的片段的转化21
• 2.2.5 质粒的提取及纯化21
• 2.2.6 目的片段的克隆21-23
• 2.2.7 目的片段的生物信息学分析23
• 2.2.8 不同胁迫处理下以及不同部位基因表达量的分析23
• 2.2.9 植物表达载体的构建23-24
• 2.2.10 拟南芥的遗传转化24
• 2.2.11 转基因植株的筛选24
• 2.2.12 纯合体植株CiCHI与CiFLS基因转录水平的检测24-25
• 2.2.13 纯合体植株CiCHI与CiFLS蛋白的检测(Western Blot)25
• 2.2.14 纯合体植株体内黄酮类化合物及花青素含量的检测25-27
• 3 结果与分析27-40
• 3.1 中间锦鸡儿总RNA的提取27
• 3.2 中间锦鸡儿CiCHI和CiFLS基因全长序列的获得27-29
• 3.2.1 CiCHI基因的保守片段克隆以及3’RACE和5’RACE27-28
• 3.2.2 CiFLS基因的3’RACE和5’RACE28
• 3.2.3 CiCHI和CiFLS基因cDNA的克隆结果及序列分析28-29
• 3.3 中间锦鸡儿CiCHI和CiFLS基因的生物信息学分析29-32
• 3.3.1 氨基酸序列分析及蛋白理化性质29-30
• 3.3.2 系统进化分析30-32
• 3.4 CiCHI与CiFLS基因对不同处理的响应及在不同部位的表达32-34
• 3.4.1 CiCHI与CiFLS基因对UV-C处理的响应32
• 3.4.2 CiCHI与CiFLS基因对NaCl处理的响应32-33
• 3.4.3 CiCHI与CiFLS基因对ABA处理的响应33-34
• 3.4.4 CiCHI与CiFLS基因在不同部位的表达34
• 3.5 筛选CiCHI和CiFLS转基因纯合体植株34-37
• 3.5.1 CiCHI和CiFLS基因的过表达载体构建34-35
• 3.5.2 转基因植株的筛选35-36
• 3.5.3 转基因纯合体植株转录水平的qRT-PCR检测结果36-37
• 3.5.4 转基因纯合体植株蛋白的检测37
• 3.6 转基因纯合体植株总黄酮及花青素含量的检测37-40
• 3.6.1 过表达CiCHI基因的转基因植株体内总黄酮及花青素的含量37-39
• 3.6.2 过表达CiFLS基因的转基因植株体内总黄酮及花青素的含量39-40
• 4 讨论与结论40-42
• 4.1 讨论40-41
• 4.1.1 过表达CiCHI基因提高植株体内总黄酮的含量40
• 4.1.2 过表达CiFLS基因未能改变植株体内总黄酮及花青素的含量40-41
• 4.2 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-50
• 作者简介50

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本文编号：440013