肾蕨查尔酮合成酶基因的克

发布时间：2017-06-11 04:07

  本文关键词：肾蕨查尔酮合成酶基因的克隆、表达及其影响因素，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蕨类植物具有丰富黄酮类化合物,是蕨类中重要的药用成分;蕨类黄酮的代谢途径仍不清楚,阐明其代谢途径对解释蕨类植物黄酮代谢的机制,调控黄酮的表达具有重要意义;肾蕨(Nephrolepis auriculata(Eaton)O.Ktze)是传统的中药材,含有丰富的黄酮类化合物,具有治疗感冒发烧、咳嗽、痢疾及抗癌等功能。肾蕨具有容易采集、培养的特点,本文以肾蕨为材料,对其黄酮含量进行了测定,克隆到其查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因,并对该基因做了原核表达,对其进行原核表达条件进行了优化及基因功能的分析。本研究对阐明蕨类植物黄酮代谢及调控的机制具有一定的科学意义。本研究获得的主要结果如下:1.分别对肾蕨的根茎、叶轴、羽片总黄酮进行了测定,结果表明肾蕨含有丰富的黄酮,叶轴和羽片中的黄酮含量均为2%左右,根茎中的黄酮含量显著高于地上部分,达到6%。由此肾蕨可作为试验材料进行黄酮代谢途径分子生物学研究。2.对肾蕨的查尔酮合成酶进行基因克隆与功能分析:以肾蕨叶中提取的RNA为模板,通过PCR技术获得肾蕨的查尔酮合成酶基因ORF序列和基因组序列。生物信息学分析表明,该基因ORF区为1209 bp,编码402个氨基酸,蛋白酶分子量为44 KD。含有一个内含子并且遵循gt/ag剪切规则。BLAST序列比对发现肾CHS基因(Na CHS)与其它物种的该基因同源,通过构建进化树进行同源性分析,表明Na CHS基因与渐尖毛蕨、槐叶萍、水蕨等蕨类的CHS基因亲缘关系更近。分析表明不同物种CHS基因在序列上有差异,这种差异对揭示物种间亲缘关系有重要意义,或者对基因功能有一定影响。将CHS目的片段与Pet32a载体连接构建原核表达载体转化到大肠杆菌BL21中,使用IPTG诱导蛋白表达,进行SDS-PAGE分析,肾蕨CHS基因在大肠杆菌中得到表达,形成了一个大小为63 KD的蛋白,与预期结果相符合。体外酶活实验验证了原核表达的肾蕨CHS蛋白具有活性,能催化底物生成柚皮素,进一步说明表达的蛋白为Na CHS。3.原核表达影响因素。(1)以IPTG为诱导剂诱导蛋白表达,对表达的蛋白进行定量检测,蛋白表达量呈增长趋势,且在表达1 h时蛋白表达变化量最明显,4 h时累计蛋白表达量最多;(2)设置IPTG浓度梯度,在诱导表达4h时取样检测菌体浓度及进行蛋白定量检测,随着IPTG浓度增大,菌体生长有受到抑制趋势,加入IPTG浓度至0.1-0.2 mmol/L蛋白表达量较大;(3)设置温度梯度,分别为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃及40℃,随温度增高表达蛋白总量有增大趋势,其他实验证实在37℃时菌体生长最快,且本实验证实在37℃表达的CHS中依然有一部分具有可溶性,最适表达温度为37℃;(4)设置菌体诱导表达前浓度梯度,浓度分别为0.224,0.385,0.621,1.120。在菌体浓度为0.621和1.120表达量较高。综上所述,黄酮含量测定表明肾蕨含有丰富的黄酮类化合物,分子生物学研究表明克隆到的Na CHS基因表达的CHS是肾蕨黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶;功能分析表明Na CHS基因原核表达产物具有较高的酶活性;经实验分析CHS最佳诱导条件为:菌体生长至OD600=0.6左右,以0.1 mmol/L IPTG在37℃诱导1 h为最佳表达条件。本研究为蕨类黄酮类化合物的生物合成途径的研究奠定了基础,对阐明蕨类植物中黄酮类化合物生物合成的调控机制也具有一定意义。
【关键词】：查尔酮合成酶 肾蕨 黄酮 原核表达
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-29
• 1.1 蕨类植物概述14-19
• 1.1.1 蕨类植物的分类地位与分布14
• 1.1.2 蕨类植物的综合利用价值14-16
• 1.1.3 蕨类植物分子生物学研究进展16-17
• 1.1.4 肾蕨17-19
• 1.1.4.1 肾蕨的分类地位与分布17
• 1.1.4.2 肾蕨的形态特征与生境17-18
• 1.1.4.3 肾蕨的研究进展18-19
• 1.2 黄酮类化合物研究进展19-23
• 1.2.1 黄酮类化合物的结构与分类19-20
• 1.2.2 黄酮类化合物的功能20-21
• 1.2.3 黄酮类化合物的生物合成途径21-22
• 1.2.4 蕨类植物中黄酮类化合物的研究进展22-23
• 1.3 查尔酮合成酶研究进展23-29
• 1.3.1 查尔酮合成酶基因的结构23-24
• 1.3.2 查尔酮合成酶蛋白的结构和作用底物24-25
• 1.3.3 查尔酮合成酶基因的进化25-26
• 1.3.4 查尔酮合成酶基因的表达调控26-28
• 1.3.5 查尔酮合成酶在植物防御中的作用28-29
• 第二章 肾蕨查尔酮合成酶基因的克隆、原核表达及条件优化29-50
• 2.1 引言29-30
• 2.2 材料和方法30-50
• 2.2.1 实验材料30-32
• 2.2.1.1 植物材料30
• 2.2.1.2 实验使用设备30-31
• 2.2.1.3 酶与分子生物学试剂31-32
• 2.2.1.4 实验菌株32
• 2.2.1.5 实验质粒32
• 2.2.1.6 实验重组质粒32
• 2.2.1.7 引物合成与测序32
• 2.2.2 方法32-50
• 2.2.2.1 肾蕨各部分样品总黄酮提取液含量的测定32-34
• 2.2.2.2 肾蕨总RNA的提取34-35
• 2.2.2.3 cDNA的合成35
• 2.2.2.4 设计简并引物35-36
• 2.2.2.5 PCR获得核心片段36
• 2.2.2.6 琼脂糖凝胶电泳检测36
• 2.2.2.7 核心片段的回收纯化36-37
• 2.2.2.8 核心片段的连接、转化及鉴定37
• 2.2.2.9 NaCHS基因的 3’RACE37-38
• 2.2.2.10 NaCHS基因的 5’RACE38-42
• 2.2.2.11 肾蕨查尔酮合成酶基因ORF序列的获得42-43
• 2.2.2.12 构建原核表达载体43-45
• 2.2.2.13 诱导蛋白表达和鉴定45-47
• 2.2.2.14 肾蕨查尔酮合成酶活性测定47-48
• 2.2.2.15 肾蕨查尔酮合基因原核表达条件优化48-50
• 第三章 结果与讨论50-67
• 3.1 蕨各部位总黄酮提取液含量的测定50
• 3.2 肾查尔酮合成酶（NACHS）基因的克隆50-55
• 3.2.1 肾蕨总RNA的提取50-51
• 3.2.2 肾蕨查尔酮合成酶基因核心片段克隆结果51-52
• 3.2.3 3'端基因序列的克隆52-53
• 3.2.4 5'端基因序列的克隆53-54
• 3.2.5 肾蕨查尔酮合成酶ORF序列的获得54-55
• 3.3 肾查尔酮合成酶（NACHS）基因的生物学分析55-57
• 3.3.1 肾蕨查尔酮合成酶ORF序列分析55
• 3.3.2 肾蕨查尔酮合成酶DNA man软件分析55-56
• 3.3.3 肾蕨查尔酮合成酶Proteinblast分析56-57
• 3.4 肾查尔酮合成酶（NACHS）基因的原核表达57-60
• 3.4.1 载体和目的基因双酶切鉴定57-58
• 3.4.2 诱导蛋白表达和鉴定58
• 3.4.3 肾蕨查尔酮合成酶酶活测定58-60
• 3.5 肾查尔酮合成酶（NACHS）基因的原核表达条件优化60-62
• 3.5.1 不同浓度IPTG对菌体生长和蛋白表达影响60
• 3.5.2 诱导时间对蛋白酶表达量影响60-61
• 3.5.3 诱导温度对蛋白酶表达量影响61
• 3.5.4 诱导前菌体浓度对表达影响61-62
• 3.6 讨论62-67
• 3.6.1 肾蕨中的黄酮化合物62-63
• 3.6.2 查尔酮合成酶基因的进化63-64
• 3.6.3 查尔酮合成酶蛋白特性64-65
• 3.6.4 肾蕨查尔酮合成酶基因原核表达条件优化探讨65-67
• 第四章 总结与展望67-68
• 参考文献68-76
• 致谢76-78
• 攻读学位期间的研究成果78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 祝留记;;用显微投影仪观察肾蕨的孢子囊弹射孢子[J];生物学通报;1988年02期

2 陈晓清;苏育才;李晓晶;林燕清;卢丹清;;抗菌肾蕨多糖的提取与分离[J];漳州师范学院学报(自然科学版);2006年04期

3 林秦文;;家乡的肾蕨[J];大自然;2009年04期

4 冯莉，田兴山，李庚午，朱命炜;肾蕨离体培养过程中形态发生的扫描电镜观察[J];电子显微学报;1994年05期

5 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 冯莉;田兴山;李庚午;朱命炜;;肾蕨离体培养过程中形态发生的扫描电镜观察[A];第八次全国电子显微学会议论文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 薛守纪;盆栽肾蕨[N];中国花卉报;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 闫循齐;肾蕨查尔酮合成酶基因的克隆、表达及其影响因素[D];上海师范大学;2016年

2 潘志明;砷汞铅镉复合污染土壤的肾蕨植物修复技术研究[D];成都理工大学;2006年

3 崔秋芳;三种观赏蕨的耐荫性研究[D];西南大学;2007年

  本文关键词：肾蕨查尔酮合成酶基因的克隆、表达及其影响因素，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：440724