棘孢木霉Hsp24基因转化山新杨培育抗病转基因株系

发布时间：2017-06-11 08:08

  本文关键词：棘孢木霉Hsp24基因转化山新杨培育抗病转基因株系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：杨树具有无性繁殖容易、生长速度快和生长周期短的特性,是重要的纤维用材,在全世界被广泛种植。然而许多生物及非生物因子对杨树的生长造成了严重的影响,减少了木材产量。而木霉作为优良的生防真菌,具有大量的防卫响应及抗病基因,如热激蛋白基因,其在木霉的生物防治机制中起到了十分重要的作用。本实验以棘孢木霉ACCC30536转录组测序数据为基础,克隆到了热激蛋白基因Hsp24的DNA序列,由于此基因无内含子,cDNA与DNA序列一致,GenBank接受号为KP337939,全长为657bp,编码218个氨基酸。生物信息学分析表明,热激蛋白Hsp24的分子量为24.3kDa,等电点是5.50,属于Hsp20家族。通过实时荧光定量方法,研究了棘孢木霉ACCC30536热激蛋白基因Hsp24在10种条件下的表达特性,结果显示,在碱、盐、干旱、高温和杨树叶枯病及烂皮病发酵液胁迫下,热激蛋白基因的表达量均上调,尤其在高温和杨树烂皮病胁迫下上调最高,分别为51.6和31.1倍。为了构建具备良好抗病性的山新杨转化子,通过农杆菌介导的方法将Hsp24基因整合到山新杨基因组上,并成功得到重组株系Pdpap-Hsp24s。RT-qPCR检测发现对照山新杨Pdpap-Con中无Hsp24基因表达,而山新杨转化子Pdpap-Hsp24s中Hsp24基因大量表达,证实Hsp24已经在转化子中成功的转录。转基因杨树病程相关蛋白基因PR表达检测发现转化子pROK2-Hsp24s中的大部分PR基因上调表达,尤其是转化子Pdpap-Hsp24-3中的PR-8被上调了215.93倍。在杨树烂皮病的胁迫下,杨树抗病信号传递相关基因的RT-qPCR发现Pdpap-Hsp24-3中的NPR1基因被上调了4.76倍,Pdpap-Hsp24-1中的JAR1和MYC2分别被上调了2.35和4.08倍。进而,NBT及EtBr叶片染色发现转化子Pdpap-Hsp24s与对照Pdpap-Con相比叶片的颜色更浅,表明转化子Pdpap-Hsp24s具有更强的抗杨树烂皮病的能力。POD及SOD酶活性检测发现Pdpap-Hsp24s与Pdpap-Con相比,POD及SOD酶活性更高,最高时分别达到37.7U和51.17U；用叶枯病侵染叶片后,发现Pdpap-Hsp24s和Pdpap-Con的叶片发病率分别为53%和81%,表明山新杨转化子Pdpap-Hsp24s具有更强的抗杨树叶枯病的能力。综上所述,棘孢木霉ACCC30536热激蛋白Hsp24基因在山新杨中的表达提高了转化子Pdpap-Hsp24s的抗病能力。本研究使人们更加深刻的了解了真菌热激蛋白能够在木本植物中成功表达,同时也提供了一种提高山新杨抗真菌病原菌能力的有效方法。
【关键词】：棘孢木霉 热激蛋白 转基因 抗真菌能力 山新杨
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S763.7
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 绪论9-14
• 1.1 课题背景及意义9-10
• 1.2 国内外文献综述及研究进展10-13
• 1.2.1 植物转基因方面10
• 1.2.2 生防木霉与病原菌互作10-12
• 1.2.3 热激蛋白的功能12-13
• 1.3 研究不足及待深入研究的问题13
• 1.4 课题来源及研究内容13-14
• 1.4.1 课题来源13
• 1.4.2 研究内容13-14
• 2 棘孢木霉热激蛋白基因Hsp24的克隆及分析14-26
• 2.1 实验材料14-15
• 2.1.1 质粒及菌株14
• 2.1.2 培养基及缓冲液14
• 2.1.3 药品14
• 2.1.4 实验器材14-15
• 2.2 实验方法15-17
• 2.2.1 棘孢木霉基因组DNA的提取15
• 2.2.2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆15-17
• 2.2.3 Hsp24启动子区序列克隆17
• 2.2.4 Hsp24基因及蛋白的生物信息学特征17
• 2.3 实验结果17-25
• 2.3.1 棘孢木霉基因组DNA的提取17-18
• 2.3.2 棘孢木霉Hsp24基因的克隆18
• 2.3.3 棘孢木霉Hsp24基因启动子区克隆及分析18-19
• 2.3.4 棘孢木霉Hsp24基因的序列分析19-20
• 2.3.5 热激蛋白Hsp24的生物信息特征分析20-25
• 2.4 热激蛋白基因的克隆及生物信息分析的讨论25
• 2.4.1 棘孢木霉Hsp24基因的克隆25
• 2.4.2 热激蛋白及其基因的生物信息分析25
• 2.5 本章小结25-26
• 3 棘孢木霉热激蛋白基因Hsp24的差异表达26-36
• 3.1 实验材料26-27
• 3.1.1 菌株26
• 3.1.2 培养基26
• 3.1.3 药品及工具酶26
• 3.1.4 实验器材26-27
• 3.2 实验方法27-29
• 3.2.1 棘孢木霉Hsp24基因的表达差异27-28
• 3.2.2 荧光定量PCR实验28-29
• 3.3 实验结果29-35
• 3.3.1 Hsp24基因在MM培养基中的表达29-30
• 3.3.2 生物因素胁迫下Hsp24基因的表达30-32
• 3.3.3 非生物压力胁迫下Hsp24基因的表达32-35
• 3.4 棘孢木霉Hsp24基因表达情况的讨论35
• 3.4.1 生物因素对Hsp24基因表达的影响35
• 3.4.2 非生物因素对Hsp24基因表达的影响35
• 3.5 本章小结35-36
• 4 山新杨转化子Pdpap-Hsp24s的构建36-46
• 4.1 实验材料36-37
• 4.1.1 植物、菌株和质粒36
• 4.1.2 培养基36-37
• 4.1.3 药品和酶制剂37
• 4.1.4 实验仪器37
• 4.2 实验方法37-42
• 4.2.1 重组载体pROK2-Hsp24的构建37-39
• 4.2.2 重组根癌农杆菌EHA105-Hsp24的构建39-41
• 4.2.3 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的获得41-42
• 4.3 实验结果42-45
• 4.3.1 重组载体pROK2-Hsp24的构建42-44
• 4.3.2 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的扩繁与检测44-45
• 4.4 植物表达载体及杨树转化子构建的讨论45
• 4.5 本章小结45-46
• 5 山新杨转化子Pdpap-Hsp24s的抗病性检测46-60
• 5.1 实验材料46
• 5.1.1 植物材料及病原真菌菌株46
• 5.1.2 培养基46
• 5.1.3 药品和酶制剂46
• 5.1.4 实验器材46
• 5.2 试验方法46-49
• 5.2.1 四个转化子株系中病程相关蛋白的表达分析46-47
• 5.2.2 杨树烂皮病胁迫下杨树转化子防卫信号途径相关基因的分析47-48
• 5.2.3 杨树烂皮病胁迫下山新杨转化子细胞膜透性及活性氧含量测定48
• 5.2.4 叶枯病菌胁迫下杨树转化子Pdpap-Hsp24抗氧化能力分析48-49
• 5.2.5 山新杨转化子Pdpap-Hsp24的抗叶枯病能力检测49
• 5.3 实验结果49-57
• 5.3.1 山新杨转化子中病程相关蛋白基因PR的表达检测49-51
• 5.3.2 杨树烂皮病的胁迫下杨树转化子防卫信号途径相关基因的表达51-53
• 5.3.3 杨树烂皮病的胁迫下杨树转化子的细胞膜透性及活性氧含量53-55
• 5.3.4 杨树叶枯病的胁迫下杨树转化子的抗氧化能力分析55-56
• 5.3.5 转化子Pdpap-Hsp24的抗杨树叶枯病能力检测56-57
• 5.4 山新杨转化子Pdpap-Hsp24抗病能力讨论57-59
• 5.4.1 转化子Pdpap-Hsp24病程相关基因的表达57
• 5.4.2 转化子Pdpap-Hsp24抗杨树烂皮病的能力57-58
• 5.4.3 转化子Pdpap-Hsp24抗杨树叶枯病的能力58-59
• 5.5 本章小结59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-66
• 附录66-67
• 攻读学位期间发表的学术论文67-68
• 致谢68-69

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本文编号：441144