家蚕胆碱激酶基因的原核表达与蛋白质纯化及在农药残留检测中的应用

发布时间：2017-06-15 14:02

  本文关键词：家蚕胆碱激酶基因的原核表达与蛋白质纯化及在农药残留检测中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙酰胆碱酯酶(Ach E)是有机磷(OP)和氨基甲酸酯类农药的作用靶蛋白,在体外胆碱激酶(choline kinase)可专一性地以三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸的供体,催化Ach E的酶促反应产物氯化胆碱发生磷酸化。依据家蚕基因组数据库中的胆碱激酶基因(Bmcok)序列(Gen Bank登录号:AK378994.1)设计合成特异引物,从家蚕5龄第3天幼虫头部克隆了家蚕胆碱激酶基因,在大肠杆菌中进行原核表达并纯化目的蛋白质,获得质量浓度约1.03 mg/m L的家蚕胆碱激酶液。纯化的家蚕胆碱激酶在30℃、p H 9.5时的活性最高,约为115.6 U/mg。通过耦合Ach E和家蚕胆碱激酶的酶催化反应,并结合ATP-荧光素发光反应,建立酶抑制-发光快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法。该方法对甲胺磷残留的检测限可达0.05μg/m L,灵敏度高于现有的酶抑制色卡法和酶抑制分光光度计法,初步表明了将家蚕胆碱激酶应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测的可行性。
【作者单位】： 浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地浙江省农业科学院蚕桑研究所;
【关键词】： 家蚕 胆碱激酶 基因克隆 原核表达 农药残留 酶抑制法 发光检测
【基金】：国家高技术研究发展计划“863”项目(No.2011AA100806) 浙江省蚕桑产业科技创新团队专项(No.2011R50028)
【分类号】：S881.2;S481.8
【正文快照】： 磷酸胆碱是细胞膜脂质双分子层结构的主要成分,不仅作为膜结构物质,而且与细胞膜融合、胞饮作用、膜转运作用以及酶催化活性有关,其在真核细胞中主要通过Kennedy途径合成[1]。胆碱激酶(choline kinase,COK)是催化Kenndey合成途径第一步的酶,在一定条件下也是该代谢途径的调节

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本文编号：452586