山东省仔猪腹泻相关病毒感染状况调查及流行性腹泻病毒S基因的遗传进化分析

发布时间：2017-06-15 15:06

  本文关键词：山东省仔猪腹泻相关病毒感染状况调查及流行性腹泻病毒S基因的遗传进化分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新生仔猪腹泻是造成仔猪高死亡率及影响猪场生产成绩和经济效益的重要因素,导致腹泻的因素除饲养管理不良外,病原感染是最重要的影响因素。引起仔猪腹泻的病原主要有两类,即病毒和细菌。其中病毒性因素是当前引起新生仔猪腹泻的主要因素。临床上仔猪病毒性腹泻混合感染现象较为普遍,致腹泻病毒的侵害部位、致病性质、临床症状及病理变化极为相似,很难单纯依靠临床症状及病理变化进行确诊,给仔猪腹泻病的诊断、防制工作带来了极大的挑战。为了明确山东省2014-2015年仔猪腹泻相关病毒的感染状况及发病规律,建立猪流行性腹泻病毒防控技术。我们对山东省2014-2015年间部分仔猪腹泻患病猪场的发病情况进行了调查分析,搜集了山东省多个地市的68份病情较重的仔猪腹泻临床病例,采集病料,对胃肠道组织学病变进行了观察,利用RT-PCR/PCR技术及免疫组织化学方法进行了相关病毒检测。结果表明,山东省仔猪腹泻病的发病季节性越来越不明显,由寒冷冬春季节多发转变为四季常发,并且发病日龄有扩大趋势,病情也显著加重,给仔猪病毒性腹泻的防控带来了更大的挑战。流行毒株主要侵害以空肠为主的小肠段黏膜上皮细胞,肠道表现急性出血性坏死性炎症。病毒检测结果显示,在68份病料中致腹泻病毒的检出率为88.24%(60/68),其中PEDV单独感染致病的比例为82.35%(56/68),TGEV单独感染并致病的比例为2.94%(2/68),腹泻性病毒混合感染并致病的比例为2.94%(2/68),但没有发现因PoRV单独感染致病的病例。研究结果表明山东省新生仔猪腹泻主要由病毒感染所致,以PEDV单独感染为主,其中腹泻性病毒混合感染的比例较低,TGEV单独感染并致病的比例极低;PEDV已经成为导致山东省猪场仔猪病毒性腹泻的主要病原。为了进一步揭示PEDV的分子特征和分子流行病学规律,为防控PED提供理论依据,对10株山东PEDV分离株的纤突蛋白基因(S)的全长进行序列测定及分析。结果表明10株PEDV的S基因全长为4161-4170nt,编码1387-1390个氨基酸。同源性分析结果表明,10株山东分离株间的核苷酸同源性(97.9%-99.5%)和氨基酸同源性(96.9%-98.8%)较高;山东分离株与美国株MN及中国株KJL-2012的核苷酸同源性(98.2%-99.4%)和氨基酸同源性(97.8%-99.1%)较近,而与国内早期分离的毒株CH/S(1986)、比利时株CV777及国内使用的疫苗株CV777核苷酸同源性(93.4%-93.9%)和氨基酸同源性(92.2%-92.9%)较远。氨基酸序列分析表明,新分离株与国内使用的疫苗株CV777相比在多个位点氨基酸有特异的替换和插入,替换和插入的氨基酸与病毒的毒力及抗原性变化的关系尚需进一步研究。总的来说,山东省仔猪病毒性腹泻的发病规律发生了明显变化,引起病毒性腹泻的病原主要是PEDV;且山东省PEDV的S基因与其他分离株相比具有独特的分子特征,新分离株的毒力及现有疫苗对这些毒株的保护效果有待于进一步实验研究。
【关键词】：PEDV S基因 流行病学 遗传距离 进化树分析 抗原表位
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 符号及缩略词说明4-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-22
• 1.1 流行性腹泻的概述11-13
• 1.1.1 PED的流行病学11-12
• 1.1.2 PED的临床症状及剖检变化12
• 1.1.3 PED的病理变化12-13
• 1.2 流行性腹泻病毒13-14
• 1.2.1 PEDV的分类13
• 1.2.2 PEDV的形态结构13
• 1.2.3 PEDV的理化特性13-14
• 1.2.4 PEDV的培养特性14
• 1.3 PEDV的分子生物学结构14-17
• 1.3.1 PEDV的基因组结构14-15
• 1.3.2 PEDV的主要基因及其产物15-17
• 1.3.2.1 S基因15-16
• 1.3.2.2 E基因16
• 1.3.2.3 M基因16
• 1.3.2.4 N基因16
• 1.3.2.5 ORF3基因16-17
• 1.4 PED检测诊断技术17-19
• 1.4.1 RT-PCR方法17
• 1.4.2 酶联免疫吸附试验17-18
• 1.4.3 免疫荧光技术18
• 1.4.4 胶体金技术18
• 1.4.5 血清中和实验18-19
• 1.5 PED疫苗研究进展19-21
• 1.5.1 传统疫苗19-20
• 1.5.2 基因工程疫苗20-21
• 1.6 本研究的目的和意义21-22
• 2 材料和方法22-45
• 2.1 实验材料22-23
• 2.1.1 样品及临床信息22
• 2.1.2 实验动物22
• 2.1.3 质粒及受体细菌22-23
• 2.1.4 主要试剂23
• 2.1.5 主要设备及相关仪器23
• 2.2 实验所用试剂配制方法23-26
• 2.3 2014年-2015年山东省仔猪腹泻病毒感染状况调查方法26-28
• 2.3.1 实验样品的处理26-27
• 2.3.2 病料RNA的提取27
• 2.3.3 腹泻病毒RT-PCR的检测方法27-28
• 2.4 PEDV病理组织学检测28-30
• 2.5 针对PEDV N蛋白多克隆抗体的制备30-39
• 2.5.1 PEDV RNA的获取30
• 2.5.2 目的基因（PEDV-N）的获取30-31
• 2.5.3 PEDV N基因片段及PET-30a载体的双酶切、纯化回收及连接31-32
• 2.5.4 重组质粒PET-30a-PEDVN的获取及鉴定32-34
• 2.5.5 重组质粒PET-30a-PEDVN在大肠杆菌（BL21）中的表达34-35
• 2.5.6 诱导产物的检测35-37
• 2.5.7 蛋白质纯化37-39
• 2.6 免疫组织化学检测39-40
• 2.7 PEDV流行毒株S基因遗传变异分析40-45
• 2.7.1 引物设计40-41
• 2.7.2 样品处理41
• 2.7.3 病料RNA的提取41
• 2.7.4 PEDV S基因的扩增41-45
• 3 结果与分析45-60
• 3.1 2014年-2015年山东省仔猪腹泻病毒感染状况调查45-46
• 3.1.1 仔猪腹泻病毒检测结果45-46
• 3.2 腹泻仔猪组织病理学检测结果46-47
• 3.3 多克隆抗体制备实验结果47-51
• 3.3.1 PEDV N基因扩增结果47
• 3.3.2 重组质粒的鉴定结果47-51
• 3.4 免疫组织化学检测结果51-52
• 3.5 PEDV流行毒株S基因遗传变异分析52-60
• 3.5.1 PEDV S基因目的基因扩增结果52
• 3.5.2 重组质粒鉴定结果52-53
• 3.5.3 PEDV S基因序列分析53-55
• 3.5.4 PEDV S1蛋白抗原表位域及抗原表位分析55-56
• 3.5.5 PEDV S基因同源性比较56-58
• 3.5.6 PEDV S基因遗传进化分析58-60
• 4 讨论60-62
• 4.1 山东省仔猪腹泻感染情况及流行规律60
• 4.2 PEDV S1蛋白抗原表位域及抗原表位分析60-61
• 4.3 PEDV S基因遗传进化分析61-62
• 5 结论62-63
• 6 参考文献63-68
• 7 附录68-69
• 8 致谢69-71
• 9 硕士期间发表论文情况71

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