水稻osmgd2-1α突变体的功能互补及相关基因表达变化的分析

发布时间：2017-06-16 02:09

  本文关键词：水稻osmgd2-1α突变体的功能互补及相关基因表达变化的分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在真核生物中,生物膜系统对于其生命活动不可或缺,其脂质二层膜把膜内外的环境分隔开来,使各反应可以有条不紊的发生,同时膜脂结构也使细胞膜能维持其特殊的结构和功能。非磷脂质单半乳糖二酰基甘油酯(monogalactosyldiacylglycerol,MGDG)和双半乳糖二酰基甘油脂(digalactosyldiacylglycerol,DGDG)是质体的主要膜脂质。MGDG的生物合成的过程,是由MGDG合成酶(UDP-galactose:sn-1,2-DAG3-β-galactosyltransferase or MGDG synthase,MGD)催化一个半乳糖基从供体尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)转移到sn-1,2-二酰基甘油的位置。而DGDG的合成是以MGDG为底物进行的,所以MGDG合成酶是半乳糖脂生物合成和质体膜结构合成的关键酶。前期启动子驱动GUS基因表达和定量PCR的实验结果显示:OsMGD2偏爱在二核和成熟期的花粉中表达;针对OsMGD2的RNA干涉实验结果显示:干涉植株呈现花粉发育异常,花粉可染率下降的表型,推测OsMGD2在水稻花粉后期发育过程中起作用。本研究在上述已有研究基础上,通过OsMGD2启动子区T-DNA插入突变体osmgd2-1α的基因功能互补及过表达实验,进一步对OsMGD2基因在水稻花粉发育中的功能进行验证和分析;通过对突变体的基因芯片分析,了解OsMGD2表达下调时,与其相关的代谢途径其它基因表达变化的情况。本论文的主要研究结果如下:1.通过双引物法鉴定T-DNA插入突变体osmgd2-1的基因型,分析了两代三批材料总计170株,结果显示杂合突变体(116株):纯合野生型(54株)=2.15:1,未分离得到纯合突变体。2.观察了突变体osmgd2-1 T_4至T5代成熟花粉KI-I2染色及结实率的情况,发现杂合突变体osmgd2-1的花粉可染率和结实率均存在a/b两种情况:osmgd2-1α,与中花11相比,花粉可染率下降至55%~60%,结实率下降至40%~50%,差异显著;osmgd2-1b,花粉可染率和结实率与中花11对照无明显差异。结合黄任平(2013)T_1-T_3代结实率的统计数据,总体结果显示突变体T_1至T5代osmgd2-1α所占比例呈逐代增多,而osmgd2-1b植株所占比例呈逐代递减的趋势。3.取二孢时期的颖花为材料,进行了基因芯片转录表达谱分析,与中花11(对照)相比,突变体osmgd2-1α中上调表达2倍以上的基因有308个,下调表达2倍以上的基因有117个。表达差异基因的聚类和富集分析结果显示,变化基因主要集中在细胞质膜成分、核糖核酸成分,细胞生长发育,核酸转录过程等相关途径。4.将OsMGD2自身启动子驱动的OsMGD2功能互补载体,通过农杆菌介导法导入突变体osmgd2-1α,获得了功能互补转化植株4个株系(H1-1、H1-2、H9-1和H9-2),共16株。采用荧光定量PCR技术,对所获得的功能互补转化苗二孢期颖花OsMGD2表达情况进行了分析,结果显示:T_1代除H1-1外,H1-2、H9-1和H9-2的OsMGD2表达量低于中花11对照,但较突变体osmgd2-1α有显著的增加;T_0代和T_1代H1-2、H9-1和H9-2三个株系的花粉可染率,相对于突变体osmgd2-1α也均有了明显的增加。上述功能互补实验结果显示:克隆的OsMGD2自身启动子,虽然没有能让功能互补转化株中OsMGD2表达恢复到对照中花11中的表达水平,但也验证了OsMGD2表达水平的部分恢复,与花粉可染率表型恢复呈正相关,表明水稻中偏爱在二核和成熟花粉中表达的OsMGD2,确实在花粉的发育成熟过程中起作用。5.将ubi启动子驱动的OsMGD2过表达载体,通过农杆菌介导法导入受体中花11,获得了过表达转化植株3个株系(G2、G4、G5),共11株。对所获得的OsMGD2过表达转化苗进行了荧光定量PCR检测和表型观察分析。荧光定量PCR分析结果显示,过表达转化苗叶子的OsMGD2的表达水平和过表达转化苗二孢期颖花OsMGD2的表达水平都显著提高,但是花粉可染率和结实率与对照组中花并无明显差异。
【关键词】：水稻 突变体 基因芯片 单半乳糖二酰基甘油脂合成酶 功能互补
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词与英汉对照7-10
• 1. 前言10-13
• 1.1 研究背景10-12
• 1.2 研究基础12-13
• 1.3 研究内容13
• 2. 材料与方法13-24
• 2.1 实验材料13-17
• 2.1.1 植物材料13
• 2.1.2 PCR扩增引物13-15
• 2.1.3 主要药品和试剂15
• 2.1.4 主要仪器设备15-16
• 2.1.5 主要试剂配方16
• 2.1.6 植物培养基配方16-17
• 2.2 实验方法17-24
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备17
• 2.2.2 连接产物电激转化农杆菌17-18
• 2.2.3 农杆菌介导的遗传转化18
• 2.2.4 突变体基因型检测和转化植株的PCR分子检测18-20
• 2.2.5 水稻总RNA抽提与cDNA的合成20-21
• 2.2.6 实时定量PCR定量21-23
• 2.2.7 水稻植株结实率、花粉可染率检测23-24
• 2.2.8 基因芯片实验24
• 3. 结果与分析24-47
• 3.1 突变体osmgd2-1 植株分析24-39
• 3.1.1 OsMGD2突变体osmgd2-1 T_4-T_6代植株基因型分析24-26
• 3.1.2 突变体osmgd2-1 植株花粉可染率和种子结实率的分析26-28
• 3.1.3 突变体osmgd2-1α植株的基因芯片分析28-39
• 3.2 功能互补转化苗的分析39-43
• 3.2.1 功能互补转化苗T_0代PCR鉴定40
• 3.2.2 功能互补转化苗T_0代花粉KI-I_2可染率与结实率分析40-42
• 3.2.3 功能互补转化苗T_1代分子检测42-43
• 3.2.4 功能互补转化苗T_1代花粉可染率和结实率的分析43
• 3.3 过表达转化苗的分析43-47
• 3.3.1 过表达转化苗T_0和T_1代分子检测44-45
• 3.3.2 过表达转化苗T_0代T_1代花粉KI-I_2可染率与结实率分析45-47
• 4.讨论与结论47-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-54

【参考文献】

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1 林冰;水稻OFP1与OFP2的转基因功能研究[D];扬州大学;2011年

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本文编号：454119