夏枯草迷迭香酸合成途径关键酶基因的克隆及毛状根体系的建立

发布时间：2017-06-15 23:10

  本文关键词：夏枯草迷迭香酸合成途径关键酶基因的克隆及毛状根体系的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：夏枯草(Prunella vulgaris L.)是中国乃至亚洲地区广泛使用的药用植物,具有多样的药理作用。《中华人民共和国药典》(2015版,一部)中规定,迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是用于鉴定夏枯草药材品质的指标性成分。同时迷迭香酸也具有多种生物活性,是一种重要的酚酸类次生代谢产物,其生物活性和生源途径都被广泛地研究。本研究采用同源克隆的方法克隆了夏枯草迷迭香酸生源途径上两个重要酶的基因,即迷迭香酸合成酶(PvRAS)和细胞色素P450单加氧酶(PvCYP),并对它们的开放阅读框(Open reading frame,ORF)进行了生物信息学分析,以确定这两种蛋白的进化分类;此外,本研究还构建了夏枯草的毛状根培养体系,并研究了诱导子对毛状根生物量、迷迭香酸积累及相关基因表达的影响。主要结果如下:1、PvRAS(KM053280)基因的cDNA包含一个1305 bp的ORF,编码435个氨基酸;PvCYP(KM053281)基因的cDNA包含一个1530 bp的ORF,编码510个氨基酸。组织特异性表达显示,这两个基因在多种组织器官中都检测到表达,且均是在根中表达量最高。PvRAS基因的表达量由多到少依次为:根叶茎果穗;PvCYP基因的表达量由多到少依次为:根茎叶果穗。2、PvRAS蛋白的理论分子质量为48.1 kDa,等电点(p I)为5.97;PvCYP蛋白的理论分子质量为57.8 kDa,等电点(p I)为8.62。它们与其它物种的RAS和CYP蛋白具有较高的一致性,且它们均含有四种二级结构。通过比对氨基酸序列的相似性和进化树的构建,得出结论,PvRAS蛋白属于BAHD酰基转移酶蛋白家族,而PvCYP蛋白属于细胞色素P450超家族中的CYP98A亚家族。3、通过用发根农杆菌ATCC 15834侵染夏枯草的无菌苗叶片获得夏枯草毛状根。并用分子鉴定的方法鉴定出阳性毛状根株系。为筛选出最佳的诱导时机,对鉴定出的阳性毛状根进行生长曲线的测定,结果发现毛状根的生长呈明显的S型生长曲线,而15 d左右的毛状根长势最好,因此选用转接后15 d的毛状根作为诱导的材料添加诱导子。4、本研究选用乙烯利和水杨酸两种诱导子处理夏枯草毛状根并筛选最佳处理浓度,结果发现200μg/L的乙烯利和6.9 mg/L的水杨酸具有最佳的诱导作用。筛选出合适的诱导剂量和最佳诱导时机后,对夏枯草毛状根进行诱导处理,并在诱导后的不同时间点取样。两种诱导子均能增加毛状根生物量和迷迭香酸的积累,而乙烯利的诱导作用较水杨酸更为明显,加入乙烯利的毛状根在第5 d达到迷迭香酸累积的最高值(63.5 mg/g),加入水杨酸的毛状根在第2天达到迷迭香酸累积的最高值(58.3mg/g);在某些时间点,两种诱导子均未显著上调PvRAS和PvCYP基因的表达量,加入诱导子的毛状根,其基因表达水平与对照无显著差异,或低于对照。但在加入SA诱导子0.5 d后,PvRAS和PvCYP基因的表达水平均显著上调;加入Eth诱导子5 d后,PvCYP的相对表达量表现出明显的增长。
【关键词】：夏枯草 迷迭香酸 迷迭香酸合成酶 细胞色素P450 毛状根 农杆菌 乙烯利 水杨酸
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-27
• 1.1 中药现代化11-13
• 1.1.1 天然产物药物11-12
• 1.1.2 中药现代化之路12-13
• 1.2 夏枯草研究概述13-17
• 1.2.1 夏枯草化学成分14-16
• 1.2.2 夏枯草药理作用16-17
• 1.3 迷迭香酸研究概况17-21
• 1.3.1 迷迭香酸的发现17-18
• 1.3.2 迷迭香酸的合成途径18-20
• 1.3.3 参与迷迭香酸生物合成的酶20-21
• 1.4 植物代谢工程21-24
• 1.4.1 诱导子调节22
• 1.4.2 关键酶调节22-23
• 1.4.3 Pathway Remodeling and De Novo Biosynthesis23-24
• 1.4.4 其他手段24
• 1.5 本研究的目的和意义24-26
• 1.6 本研究的技术路线26-27
• 第二章 夏枯草迷迭香酸合成途径中关键酶基因的克隆与分析27-39
• 2.1 引言27
• 2.2 材料与方法27-31
• 2.2.1 实验材料27
• 2.2.2 主要试剂与仪器27-28
• 2.2.3 夏枯草PvRAS和PvCYP基因的获得28-29
• 2.2.4 夏枯草PvRAS和PvCYP基因的组织表达分析29-30
• 2.2.5 夏枯草PvRAS和PvCYP蛋白氨基酸序列分析30-31
• 2.3 结果与分析31-38
• 2.3.1 夏枯草总RNA的提取和质量检测31
• 2.3.2 夏枯草PvRAS和PvCYP基因cDNA序列的克隆31-32
• 2.3.3 夏枯草PvRAS和PvCYP基因组织特异性表达分析32-33
• 2.3.4 夏枯草RAS和CYP蛋白氨基酸序列分析33-38
• 2.4 讨论38-39
• 第三章 夏枯草毛状根的诱导体系39-49
• 3.1 引言39
• 3.2 材料与方法39-42
• 3.2.1 实验材料39
• 3.2.2 主要试剂与仪器39-40
• 3.2.3 夏枯草无菌苗的培养40
• 3.2.4 夏枯草毛状根的获得与鉴定40-41
• 3.2.5 夏枯草毛状根诱导子处理41-42
• 3.2.6 夏枯草毛状根迷迭香酸含量的测定42
• 3.2.7 夏枯草毛状根中PvRAS和PvCYP基因表达分析42
• 3.3 结果与分析42-47
• 3.3.1 夏枯草无菌苗的培养和毛状根的获得42-44
• 3.3.2 诱导子对夏枯草毛状根的影响44-47
• 3.4 讨论47-49
• 第四章 研究总结及展望49-51
• 参考文献51-57
• 附录57-58
• 致谢58-59
• 作者简介59

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