DENV-2对原代HHSECs凋亡，自噬及其相关基因表达的影响

发布时间：2017-06-17 12:00

  本文关键词：DENV-2对原代HHSECs凋亡，自噬及其相关基因表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究Ⅱ型登革病毒(DENV-2)感染原代人肝窦内皮细胞(HHSEC)后,HHSECs的凋亡、自噬情况,以及ICAM-1和Beclin-1 mRNA水平的表达,并分析它们在登革病毒致病过程中可能的机制。方法:通过流式细胞术检测细胞膜表面CD31分子;免疫组化法检测细胞浆Ⅷ因子的表达,以鉴定HHSECs。RT-PCR扩增DENV-2 NS1基因部分序列,鉴定病毒;根据NS1的序列设计酶切位点,HindⅢ酶切,预期酶切片段大小为228bp和185bp,对病毒进一步鉴定;测定DENV-2对C6/36细胞的TCID50。以105TCID50的DENV-2作用于HHSECs,实时荧光定量PCR动态检测DENV-2 NS1部分序列,以观察HHSECs受DENV-2感染的情况;CCK8法动态观察受感染细胞的损伤情况并计算其抑制率。实时荧光定量PCR动态检测被DENV-2感染的HHSECs的ICAM-1及Beclin-1(自噬相关基因)mRNA水平的表达。流式细胞术检测被DENV-2感染后的HHSECs细胞凋亡率,LC3B(自噬相关蛋白)以及ICAM-1的表达。结果:细胞呈梭形,生长良好,轮廓清晰,“鹅卵石”样排列;免疫组化法检测HHSECsⅧ因子的表达,DAB染色后与空白对照对比,可见细胞浆含棕黄色的颗粒;流式细胞仪检测CD31表达率87.1%,符合HHSECs的特点。RT-PCR扩增DENV-2NS1基因部分序列,扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定,长度在400bp左右,与预期长度413bp一致,证实为DENV-2 NS1部分基因序列;HindⅢ酶切得到两条酶切片段,长度在200bp左右,和预期一致;DENV-2毒株对C6/36细胞的TCID50为10-6.845/ml。Real time PCR检测HHSECs中NS1基因mRNA的表达:未感染组不表达NS1基因;DENV-2作用于HHSECs后,表达DEN V-2 NS1 mRNA,DENV-2可感染HHSECs并在其中增殖,且于36h达峰值,以12h为对照,计算2-△△Ct值为11.33±1.77(P0.05)。病毒作用细胞后,CCK8法检测DENV-2对细胞的毒性作用,细胞与未感染组有差别,不同时间点抑制率分别为10.9%±1.24%(12h),16.4%±0.42%(24h),17.0%±0.46%(36h),29.6%±0.26(48h)。流式细胞术动态观察被DENV-2感染的HHSEC凋亡情况,12h的凋亡率为13.17%,最为明显;之后逐渐减少,24h、36h和48h分别为4.31%,3.909%和2.975%。流式细胞术动态检测被DENV-2感染的HHSECs,其LC3B的表达于36h达到峰值,表达率为35.5%;12h,24h和48h LC3B的表达率,分别为17.0%,22.3%和20.8%。流式细胞术动态检测被DENV-2感染的HHSECs表面ICAM-1表达,12h,24h,36h和48h分别为9.17%,14.7%,12.7%,11.6%。Real time PCR检测HHSECs中相关基因mRNA的表达水平:Beclin1及ICAM-1 mRNA在24h达峰值,以未感染组为对照,2-△△Ct值分别为46.77±2.55和40.97±4.91,尔后逐渐下降。结论:HHSEC对DENV-2易感;且DENV-2对HHSECs生长有抑制作用;并可诱导ICAM-1上调,激活HHSECs。这或许可以成为探究登革病毒致病机制的新模型。HHSEC被DENV-2感染后,LC3B及Beclin1的表达增高;DENV-2感染早期可诱导HHSECs的细胞凋亡、自噬。提示细胞自噬和凋亡参与DENV感染过程,具体机制有待研究。
【关键词】：Ⅱ型登革病毒 人肝窦内皮细胞 凋亡 自噬 Beclin-1 ICAM-1
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 略缩词表9-10
• 引言10-12
• 材料与方法12-24
• 结果24-34
• 讨论34-39
• 结论39-40
• 参考文献40-47
• 附录47-48
• 综述48-57
• 参考文献52-57
• 作者简历57-58
• 致谢58-59
• 学位论文数据集59

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本文编号：458224