Sm22α基因敲除小鼠繁育新方法的建立及在宫缩乏力研究中的应用

发布时间：2017-06-17 12:00

  本文关键词：Sm22α基因敲除小鼠繁育新方法的建立及在宫缩乏力研究中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)是一种分子量22k Da的actin结合蛋白,用于血管平滑肌细胞分化及表型转化的研究。Sm22α基因敲除(Sm22α~(-/-))小鼠在人类相关疾病的研究中已得到广泛应用。然而,Sm22α~(-/-)小鼠的传统繁育方法产生的纯合型子代数量较少,且易出现宫内窘迫,引起母、胎鼠死亡,无法满足相关研究的需要。本文欲对Sm22α~(-/-)小鼠的传统繁育方法进行改进,提高子代小鼠的纯合率,进而初步探讨宫内窘迫发生的机制。方法:1 Sm22α~(-/-)小鼠纯合子繁育方法的改进采用纯合子交配方式即雄性纯合子与雌性纯合子交配,并对有分娩征兆的孕鼠实施剖腹产手术,剖出的仔鼠由ICR雌鼠代乳。同时用传统的杂合子交配方式即雄性纯合子与雌性杂合子交配作为对照,比较两种繁育方式的雌鼠受孕率及产生仔鼠的断乳后存活率。2子代小鼠基因型鉴定利用化学消化法提取两种交配方式产生的子代小鼠的基因组DNA,聚合酶连式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术扩增相应目的片段;PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后,紫外凝胶成像仪下分析小鼠基因型并计算两种繁育方法产生子代的纯合率。3 SM22α对子宫平滑肌发育的影响解剖分离野生型(Sm22α~(+/+))雌鼠与Sm22α~(-/-)雌鼠的子宫,观察比较其大体形态;通过组织冰冻切片HE染色,观察子宫壁的形态结构,应用图像分析软件计算子宫中膜平滑肌肌层相对厚度(中膜肌层厚度与子宫壁厚度的比值),进而探讨敲除Sm22α对子宫平滑肌发育的影响。4 SM22α对子宫平滑肌细胞骨架F-actin形成的影响应用偶联荧光基团的鬼笔环肽分别对野生型及Sm22α~(-/-)小鼠的子宫平滑肌组织中的F-actin进行冰冻切片荧光染色,荧光显微镜下观察荧光强度,进而定量分析F-actin的含量。5子宫平滑肌细胞原代培养及鉴定为了在细胞水平探讨SM22α在子宫平滑肌收缩中的作用,应用改良组织贴块法培养野生型及Sm22α~(-/-)小鼠子宫平滑肌细胞,倒置显微镜下观察细胞形态及生长特点并用特异性平滑肌肌动蛋白(smooth muscleα-actin,SMα-actin)的免疫荧光染色进行细胞鉴定。6 SM22α对子宫平滑肌细胞中应力纤维形成的影响为了进一步验证SM22α在actin聚合中的作用,分别对野生型及Sm22α~(-/-)小鼠的子宫平滑肌细胞中应力纤维及SM22α进行荧光染色分析,观察二者的共定位情况并分析敲除Sm22α基因对子宫平滑肌细胞中应力纤维形成的影响。7统计学处理所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示,两样本均数比较采用t检验。计数资料以百分率表示,采用χ2检验。P0.05为差异有统计学意义。结果:1纯合子繁育方式与传统杂合子繁育方式相比,雌鼠受孕率分别为50%和60%,仔鼠断乳后存活率分别为87.70%和88.60%,且两种繁育方式相比均无统计学差异(P0.05);2纯合子繁育方式与传统杂合子繁育方式产生子代的纯合子率分别为100%和47%,基本符合孟德尔遗传定律;3与野生型相比,Sm22α~(-/-)雌鼠子宫大体形态无明显差异,但其中膜平滑肌肌层相对厚度较小,与野生型相比具有显著差异(P0.05);4组织荧光染色结果显示,Sm22α~(-/-)小鼠与野生型小鼠相比子宫平滑肌纤维中细胞骨架蛋白F-actin的相对含量偏低,差异具有统计学意义(P0.05),这表明SM22α影响actin的聚合;5成功培养野生型与Sm22α~(-/-)小鼠原代子宫平滑肌细胞,倒置显微镜下观察细胞形态为梭形并呈典型的“峰-谷”样生长;特异性的SMα-actin免疫荧光染色显示,单层细胞中阳性细胞率在95%以上;6子宫平滑肌细胞应力纤维荧光染色结果显示,在野生型小鼠子宫平滑肌细胞中,应力纤维呈束状,平行排列,SM22α与应力纤维共定位;而Sm22α~(-/-)小鼠的子宫平滑肌细胞中,应力纤维稀疏,呈散在分布;这表明SM22α在应力纤维形成过程中具有重要作用。结论:1纯合子繁育方式不仅增加了子代纯合子的数量,且无需基因型鉴定。2 Sm22α缺失可导致子宫平滑肌F-actin形成障碍,进而降低子宫平滑肌收缩性。
【关键词】：SM22α 基因敲除 繁育 宫内窘迫 肌动蛋白聚合
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-19
• 结果19-21
• 附图21-25
• 附表25-26
• 讨论26-29
• 结论29-30
• 参考文献30-33
• 综述 肌动蛋白动力学与平滑肌收缩33-49
• 参考文献41-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

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本文编号：458220