炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因筛选

发布时间：2017-06-22 03:07

  本文关键词：炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：炭样小单孢菌JXNU-1是本实验室从土壤中筛选得到的一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌。前期研究已建立了从该菌发酵液中分离纯化抗生素的方法,并经分析初步确定其抗生素为一核苷类抗生素,但有关炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机制仍不清楚。本文采用组学方法筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相关基因(簇),具体内容和结果如下:1.以优化SDS法提取炭样小单孢菌JXNU-1基因组DNA,采用高通量测序技术对基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学分析,最终获得炭样小单孢菌JXNU-1全基因组精细图,相关序列已提交GenBank,获得登录号为JXSX00000000;2.以RNAiso试剂法提取发酵36 h(抗生素分泌前)和发酵108 h(抗生素分泌后)炭样小单孢菌JXNU-1总RNA,分别构建抗生素分泌前后的cDNA文库,采用Illumina Hiseq 2500测序平台对cDNA文库测序,序列已提交到NCBI SRA,获得登录号SRP066689;基于cDNA文库测序结果,得到炭样小单孢菌JXNU-1抗生素分泌后与分泌前的差异表达基因1072个,其中上调表达基因573个,下调表达基因499个。将抗生素分泌过程中表达显著上调的30个基因定位到炭样小单孢菌JXNU-1全基因组的13基因簇中,经分析初步确定基因簇cluster12为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因(簇);3.以发酵108 h的炭样小单孢菌JXNU-1菌体为实验组(Tester),发酵36h的菌体为驱动组(Driver),分别提取总RNA、合成双链cDNA,进行抑制性消减杂交,成功构建炭样小单孢菌JXNU-1发酵分泌抗生素前后的消减cDNA文库,选取部分阳性克隆进行测序,获得差异片段26个,从中筛选得到与抗生素生物合成密切相关基因5个(经荧光定量PCR验证)。根据炭样小单孢菌JXNU-1全基因组序列,上述5个基因被定位到4个基因簇中,且分析确定基因簇cluster 2极可能为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成基因(簇);4.经比对分析发现,转录组测序分析得到的基因簇cluster 12与抑制性消减杂交技术分析得到的cluster 2实际为同一基因簇,可以确定为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成基因簇,cluster 2序列已提交Gene Bank,获得登录号KU355271;上述研究结果为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成的代谢通路及调控机制提供了实验依据。
【关键词】：炭样小单孢菌 全基因组序列分析 转录组分析 抑制性消减杂交 抗生素生物合成基因簇
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q933
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略语7-11
• 1 绪论11-23
• 1.1 炭样小单孢菌研究概况11
• 1.2 核苷类抗生素11-17
• 1.2.1 概念11-12
• 1.2.2 种类12-13
• 1.2.3 生物合成基因簇13-17
• 1.3 新一代高通量测序技术的应用17-18
• 1.3.1 在DNA水平上的应用17
• 1.3.2 在RNA水平上的应用17-18
• 1.4 原核生物差异表达基因的筛选方法18-21
• 1.4.1 代表性差异分析技术18-19
• 1.4.2 限制性酶切片段差异显示19
• 1.4.3 cDNA扩增片段长度多态性19
• 1.4.4 cDNA微阵列19-20
• 1.4.5 抑制性消减杂交技术20-21
• 1.5 研究目的和意义21-23
• 2 炭样小单孢菌JXNU-1 全基因组序列分析23-39
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 菌种23
• 2.1.2 培养基23
• 2.1.3 主要药品和试剂23-24
• 2.1.4 试剂及其配制24-25
• 2.2 实验方法25-27
• 2.2.1 炭样小单孢菌JXNU-1 的培养25
• 2.2.2 基因组DNA提取25-26
• 2.2.3 凝胶电泳检测26
• 2.2.4 基因组测序、组装26
• 2.2.5 基因组组分分析26-27
• 2.2.6 基因组功能分析27
• 2.2.7 基因组比较分析27
• 2.2.8 次级代谢产物合成基因簇预测27
• 2.3 结果与分析27-38
• 2.3.1 基因组DNA提取27-28
• 2.3.2 基因组概况28-30
• 2.3.3 基因预测30-31
• 2.3.4 基因组功能注释31-34
• 2.3.5 共线性分析34-36
• 2.3.6 次级代谢产物合成基因簇36-37
• 2.3.7 全基因组序列提交37-38
• 2.4 本章小结38-39
• 3 炭样小单孢菌JXNU-1 的比较转录组分析39-55
• 3.1 实验材料39-40
• 3.1.1 菌种39
• 3.1.2 培养基39-40
• 3.1.3 实验仪器和设备40
• 3.2 实验方法40-42
• 3.2.1 炭样小单孢菌JXNU-1 的培养40-41
• 3.2.2 样品取样及活性检测41
• 3.2.3 总RNA提取41-42
• 3.2.4 RNA样品质量检测42
• 3.2.5 转录组测序42
• 3.3 结果与分析42-52
• 3.3.1 样品活性检测42-43
• 3.3.2 总RNA提取43-44
• 3.3.3 转录组分析44-46
• 3.3.4 差异表达基因统计46
• 3.3.5 差异表达基因功能注释46-49
• 3.3.6 抗生素合成相关基因筛选49-52
• 3.3.7 转录组序列提交52
• 3.4 本章小结52-55
• 4 应用SSH技术筛选炭样小单孢菌JXNU-1 中抗生素合成相关基因55-85
• 4.1 实验材料55-57
• 4.1.1 菌种55
• 4.1.2 主要分子生物学试剂55-56
• 4.1.3 引物和接头序列56
• 4.1.4 试剂及其配制56-57
• 4.1.5 培养基57
• 4.2 实验方法57-72
• 4.2.1 炭样小单孢菌JXNU-1 的培养57
• 4.2.2 样品取样及活性检测57
• 4.2.3 总RNA提取57
• 4.2.4 DNA去除57-58
• 4.2.5 双链cDNA合成58-61
• 4.2.6 抑制消减杂交61-68
• 4.2.7 SSH cDNA文库构建及克隆筛选68-70
• 4.2.8 阳性克隆测序及分析70
• 4.2.9 实时荧光定量70-72
• 4.3 结果与分析72-83
• 4.3.1 双链c DNA检测72-73
• 4.3.2 Rsa I酶切结果73-74
• 4.3.3 接头连接效率分析74-75
• 4.3.4 抑制消减杂交结果75-76
• 4.3.5 抑制性消减效率的检测76
• 4.3.6 差异表达基因的多样性鉴定76-77
• 4.3.7 差异片段序列检索分析77-78
• 4.3.8 抗生素生物合成相关基因筛选78-80
• 4.3.9 抗生素合成相关基因簇筛选80-82
• 4.3.10 基因簇序列提交82-83
• 4.4 讨论83
• 4.5 本章小结83-85
• 5 结论与展望85-87
• 5.1 结论85-86
• 5.2 展望86-87
• 参考文献87-97
• 附录I97-101
• 致谢101-102
• 在读期间公开发表论文（著）及科研情况102
• 已发表的论文102
• 参与的科研项目102

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