低温贮藏下杏鲍菇的木质化及关键酶基因的克隆与表达分析

发布时间：2017-06-22 05:09

  本文关键词：低温贮藏下杏鲍菇的木质化及关键酶基因的克隆与表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：杏鲍菇味道鲜美,具有极高的营养价值,有“平菇之王”之称。在冷藏条件下,杏鲍菇会发生硬度上升、发绵、难以咀嚼等质地劣变现象,导致失去杏鲍菇特有的脆嫩口感,并且会造成营养成分含量的下降,严重影响杏鲍菇的贮藏品质。本研究首次对低温贮藏的杏鲍菇质地变化特征进行研究,探究引起杏鲍菇采后质地劣变的原因,并通过克隆木质素生物合成过程中相关酶的基因,分析这些基因在杏鲍菇木质化过程中的表达水平,从分子水平上探讨杏鲍菇采后木质化的相关机理。主要结果如下:(1)低温贮藏的杏鲍菇质地变化特征新鲜杏鲍菇,装在低密度聚乙烯袋,分别存放在不同的低温(2℃、4℃、8℃)下18天,测量其质地性状。结果发现,在整个贮藏期间杏鲍菇发生两次增韧,并且木质素含量与3个木质素合成中关键酶活性变化高度相关。几丁质和纤维素含量与增韧表现出低相关性。我们的研究结果表明,增韧可能主要是由于木质化,从而影响杏鲍菇的采后品质。(2)木质素合成途径关键酶基因的克隆利用RT-PCR、RACE等技术,成功从杏鲍菇中克隆得到了1条PAL基因的全长序列,命名为Pe Pal;以及4条4CL基因(分别命名为Pe4cl1、Pe4cl2、Pe4cl3、Pe4cl4)和1条POD基因(命名为Pe Pod)的3’端部分序列。Pe Pal全长全长2441的序列,包含1个29bp的5’端非编码区,一个183bp的3’端非编码区,一个2229bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码743个氨基酸。Pe4cl1基因片段c DNA长度为1898bp,其中包括119bp的3’端非编码区序列和1779bp编码区序列,编码区编码了593个氨基酸。Pe4cl2基因片段c DNA长度为1620bp,编码了540个氨基酸。Pe4cl3基因片段c DNA长度为1406bp,编码了468个氨基酸。Pe4cl4基因片段c DNA长度为1012bp,编码了337个氨基酸。Pe Pod基因片段c DNA长度为754bp,其中包括109bp的3’端非编码区序列和645bp编码区序列,编码区编码了215个氨基酸。(3)杏鲍菇不同冷藏时期木质素生物合成关键酶基因的表达特征运用荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了杏鲍菇不同冷藏时期木质素生物合成关键基因的表达模式。荧光定量PCR结果显示,在贮藏时间内Pe Pal、Pe4cl1、Pe4cl3基因具有相似的表达模式(升-降-升-降)。前12天贮藏期内,不同贮藏温度下Pe Pal、Pe4cl1、Pe4cl3和Pe Pod基因表达水平曲线与PAL、POD酶活性、韧性和木质素含量都表现出相似的趋势。因此,我们推测Pe Pal、Pe4cl1、Pe4cl3和Pe Pod基因的表达可能受低温等环境因素诱导,在低温贮藏下杏鲍菇的木质化过程中起着重要的作用。
【关键词】：杏鲍菇 低温贮藏 木质化 关键酶基因 表达特征
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S646
【目录】：

• 摘要3-5
• abstract5-7
• 英文缩略语及中文对照7-12
• 1 前言12-24
• 1.1 杏鲍菇12-14
• 1.1.1 杏鲍菇简介12
• 1.1.2 杏鲍菇的营养及药用功能12-13
• 1.1.3 杏鲍菇采后贮藏保鲜研究进展13-14
• 1.2 果蔬采后质地变化14-15
• 1.2.1 采后果蔬硬化机理14-15
• 1.3 木质素合成途径15-22
• 1.3.1 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL)17
• 1.3.2 肉桂酸 4-羟化酶（cinnamate4-hydroxylase，C4H）17-18
• 1.3.3 香豆酸 3-羟化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）18
• 1.3.4 奎宁酸/莽萆酸羟基肉桂酰Co A转移酶（p-hydroxycinnamoyl-Co A:quinate/shikimatehydroxycinnamoyl transferase，HCT）18-19
• 1.3.5 阿魏酸 5-羟化酶（ferulate 5-hydroxylase，，F5H）19
• 1.3.6 咖啡酰Co A-O-甲基转移酶（caffeoyl-Co A O-methyltransferase，CCo AOMT）19-20
• 1.3.7 咖啡酸-O-甲基转移酶（caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）20
• 1.3.8 对香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）20-21
• 1.3.9 肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl-Co A reductase，CCR）21
• 1.3.10 肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）21-22
• 1.3.11 过氧化物酶（Peroxidase，POD）22
• 1.4 本研究的目的和意义22-24
• 2 材料与方法24-43
• 2.1 试验材料24
• 2.2 实验设备24-25
• 2.3 实验试剂25
• 2.4 主要试剂的配制25-26
• 2.5 试验方法26-43
• 2.5.1 低温贮藏下杏鲍菇生理生化的变化26-29
• 2.5.1.1 质构分析26
• 2.5.1.2 木质素含量的测定26-27
• 2.5.1.3 几丁质含量的测定27
• 2.5.1.4 纤维素含量的测定27
• 2.5.1.5 木质素合成关键酶的提取与测定27-29
• 2.5.2 杏鲍菇木质素合成途径关键基因克隆29-40
• 2.5.2.1 木质素合成途径相关基因中间片段的克隆29-35
• 2.5.2.2 RACE方法克隆 3’端序列35-37
• 2.5.2.3 RACE方法克隆 5’端序列37-39
• 2.5.2.4 杏鲍菇木质素合成途径基因生物信息学分析39-40
• 2.5.3 杏鲍菇木质素合成途径相关基因表达分析40-43
• 2.5.3.1 杏鲍菇材料40
• 2.5.3.2 总RNA提取以及纯度与完整性的鉴定40
• 2.5.3.3 c DNA的合成40
• 2.5.3.4 荧光定量PCR引物设计40-41
• 2.5.3.5 实时荧光定量PCR条件和实时定量分析41-43
• 3 结果与分析43-84
• 3.1 低温贮藏下杏鲍菇木质化相关的理化指标变化43-52
• 3.1.1 菌褶部位的质地变化43-44
• 3.1.2 菇体中部的质地变化44-45
• 3.1.3 菇体尾部的质地变化45-47
• 3.1.4 不同部位木质素含量变化47-48
• 3.1.5 不同部位纤维素含量变化48-49
• 3.1.6 不同部位几丁质含量变化49
• 3.1.7 PAL、CAD、POD活性49-52
• 3.2 木质化相关基因克隆52-79
• 3.2.1 杏鲍菇总RNA的提取及检测52
• 3.2.2 Pe PAL基因的克隆52-63
• 3.2.2.1 PAL基因的扩增52-53
• 3.2.2.2 Pe PAL基因序列全长53-56
• 3.2.2.3 Pe PAL基本理化性质分析56-57
• 3.2.2.4 Pe PAL结构域分析57-59
• 3.2.2.5 Pe PAL蛋白的二级结构和三级结构预测分析59-60
• 3.2.2.6 同源性比较及进化分析60-63
• 3.2.3 Pe4cl1基因片段的克隆63-66
• 3.2.3.1 Pe4cl1基因片段的扩增63
• 3.2.3.2 Pe4cl1基因片段c DNA的序列63-66
• 3.2.4 Pe4cl2基因片段的克隆66-69
• 3.2.4.1 Pe4cl2基因片段的扩增66-67
• 3.2.4.2 Pe4cl2基因片段c DNA的序列67-69
• 3.2.5 Pe4cl3基因片段的克隆69-72
• 3.2.5.1 Pe4cl3基因片段的扩增69-70
• 3.2.5.2 Pe4cl3基因片段c DNA的序列70-72
• 3.2.6 Pe4cl4基因片段的克隆72-76
• 3.2.6.1 Pe4cl4基因片段的扩增72-73
• 3.2.6.2 Pe4cl4基因片段c DNA的序列73-76
• 3.2.7 Pe Pod基因片段的克隆76-79
• 3.2.7.1 Pe Pod基因片段的扩增76
• 3.2.7.2 Pe Pod基因片段c DNA的序列76-79
• 3.3 冷藏下木质化关键基因的荧光定量PCR分析79-84
• 3.3.1 冷藏后杏鲍菇总RNA提取79-80
• 3.3.2 q RT-PCR引物的检测80-82
• 3.3.3 杏鲍菇冷藏期间木质化关键基因的表达分析82-84
• 4 讨论与结论84-90
• 4.1 杏鲍菇韧性增加84-85
• 4.2 杏鲍菇木质素合成关键基因的克隆85-87
• 4.3 低温贮藏下杏鲍菇木质素代谢关键酶基因表达分析87-88
• 4.4 结论88-90
• 致谢90-91
• 参考文献91-104
• 附录104

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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  本文关键词：低温贮藏下杏鲍菇的木质化及关键酶基因的克隆与表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：470797