PLIN1基因沉默对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响及机制探究

发布时间：2017-06-28 21:26

  本文关键词：PLIN1基因沉默对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响及机制探究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:采用RNA干扰技术沉默3T3-L1脂肪细胞中围脂滴蛋白(PLIN1)基因的表达,观察对细胞中脂解的影响,并进行分子机制探讨,为肥胖症相关生物制剂的筛选与制备提供实验基础。方法:1.采用基因重组技术构建3组阳性sh-PLIN1干扰载体以及1组阴性载体,并通过菌液PCR法和DNA测序法对其进行鉴定。2.3T3-L1前脂肪细胞采用“鸡尾酒”法诱导分化,诱导成功后脂质体法转染细胞2d。3.细胞转染成功后,采用Bodipy 493/503染色脂滴,Hoechest 33258衬染细胞核;采用酶法检测细胞中甘油三酯(TG)及甘油的含量,评价细胞脂解情况。4.转染后的细胞通过Western blot法检测细胞中围脂滴蛋白A(PLIN1A)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达;通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。另外,异丙肾上腺素(ISO)与sh-PLIN1干扰载体联合干预时,以浓度为10μM的ISO干预细胞6h。结果:1.随着细胞诱导分化的进行,3T3-L1前脂肪细胞体积增大,形态变圆,并出现脂滴。荧光染色后,脂滴呈“戒环样”围绕细胞核分布,且诱导分化第8d脂滴直径明显大于第4d。2.诱导分化第0d、4d和8d,细胞中TG含量呈上升趋势。3.3T3-L1脂肪细胞转染2d后,各组转染率均大于40%。与阴性转染组相比,3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P0.05)。4.转染sh-PLIN1干扰载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,TG含量降低,甘油含量升高;ATGL和HSL表达量显著升高(P0.05),p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均无显著性差异(P0.05)。5.ISO与sh-PLIN1干扰载体共同干预细胞后,与阴性转染组相比,ISO+sh-PLIN1转染组和sh-PLIN1转染组中ATGL表达量均显著升高(P0.05),且2组之间无明显差异(P0.05)。同时,ISO+sh-PLIN1转染组和ISO+阴性转染组中TG含量降低,甘油含量升高;HSL、p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均显著升高(P0.05),并且这些指标在2组中均无明显差异(P0.05)。结论:1.sh-PLIN1干扰载体构建成功,并且可有效下调PLIN1A蛋白的表达。2.sh-PLIN1干扰载体可促进3T3-L1脂肪细胞脂解,其机制可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,而且cAMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。3.ISO可通过激活cAMP/PKA信号通路,上调HSL和p-HSL的表达而发挥促脂解的作用,而sh-PLIN1干扰载体的促脂解作用可能并非通过cAMP/PKA信号通路介导。
【关键词】：围脂滴蛋白 RNA干扰 3T3-L1脂肪细胞 异丙肾上腺素 脂解
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 常用缩写词中英文对照表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化及脂滴荧光染色方法建立14-22
• 1 材料与方法14-18
• 1.1 实验材料14-16
• 1.2 实验方法16-18
• 2 结果18-20
• 2.13T3-L1前脂肪细胞形态学观察18-19
• 2.2 细胞诱导分化及脂滴荧光染色19-20
• 2.3 细胞中TG含量20
• 3 讨论20-21
• 4 结论21-22
• 第二部分PLIN1基因真核表达载体的构建及鉴定22-35
• 1 材料与方法22-30
• 1.1 实验材料22-25
• 1.2 实验方法25-30
• 2 结果30-33
• 2.1 sh-PLIN1重组载体菌液PCR及测序鉴定30-31
• 2.2 质粒浓度、纯度测定及大小鉴定31-32
• 2.3 细胞转染效率32-33
• 2.4 重组载体对PLIN1A蛋白表达的影响33
• 3 讨论33-34
• 4 结论34-35
• 第三部分 沉默PLIN1基因对 3T3-L1脂肪细胞脂解的影响35-42
• 1 材料与方法35-38
• 1.1 实验材料35-36
• 1.2 实验方法36-38
• 2 结果38-40
• 2.1 sh-PLIN1干扰载体对脂滴形态的影响38-39
• 2.2 sh-PLIN1干扰载体对TG和甘油含量的影响39
• 2.3 sh-PLIN1干扰载体对ATGL、HSL和p-HSL蛋白表达的影响39-40
• 2.4 sh-PLIN1干扰载体对cAMP/PKA信号通路的影响40
• 3 讨论40-41
• 4 结论41-42
• 第四部分 异丙肾上腺素与sh-PLIN1干扰载体联合干预对 3T3-L1脂肪细胞脂解影响的实验研究42-47
• 1 材料与方法42-43
• 1.1 实验材料42
• 1.2 实验方法42-43
• 2 结果43-45
• 2.1 ISO与sh-PLIN1干扰载体联合干预对TG和甘油含量的影响43-44
• 2.2 ISO与sh-PLIN1干扰载体联合干预对ATGL、HSL和p-HSL蛋白表达的影响44-45
• 2.3 ISO与sh-PLIN1干扰载体联合干预对cAMP和PKA含量的影响45
• 3 讨论45-46
• 4 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-60
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果60-61
• 个人简历61

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