巴西橡胶树冷胁迫基因HbICE1的克隆及功能研究
发布时间：2017-06-28 21:30
本文关键词：巴西橡胶树冷胁迫基因HbICE1的克隆及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：植物在生长过程中,常常会受到低温冷害等非生物逆境胁迫的严重影响。由于橡胶属于热带植物,不耐寒,所以是极易受到低温冷害影响的植物之一。而ICE1是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子,目前关于橡胶树冷胁迫信号途径中包括HbICE1在内的大部分关键基因的研究还比较匮乏,与HbICE1发生互作的蛋白仍不清楚,成为严重阻碍研究橡胶抗寒分子机理的瓶颈。本研究首先克隆HbICE1基因,分析其基因表达调控特点,然后鉴定HbICE1的互作蛋白,得到以下研究结果：1.通过电子克隆技术,得到.HbICE1基因的全长cDNA序列,然后设计引物进行RT-PCR扩增cDNA的全长编码区,测序结果与预测序列一致。其编码470个氨基酸,蛋白分子质量约为51kDa,理论等电点(pI)为5.83,为亲水性蛋白。2.经亚细胞定位实验分析,HbICE1蛋白位于细胞核上。实时荧光定量分析表明：MICE1基因在不同组织下都有表达,但在叶片中的表达最高。在不同胁迫处理下,HbICE1的表达模式也存在着较大的差异。3.构建HbICE1的cDNA全长编码框的植物过量表达载体pEGAD,然后利用电击转化法将表达载体转化到农杆菌GV3101中,再利用浸花侵染法将其转入拟南芥,获得了F1代植株12株,为后续转基因株系耐受低温胁迫的检测分析及HbICE1的生物学功能鉴定奠定了基础。4.构建橡胶HbICE1基因的pGBKT7酵母双杂交诱饵载体,并转化酵母菌株Y2H Gold,利用酵母双杂技术筛选橡胶双链cDNA文库与HbICE1互作的蛋白。对文库中获得的互作菌株提取质粒并转化大肠杆菌,选择其中48个解析测序,获得33个单一序列,并在NCBI上进行比对和注释。5.为了验证HbICE1是否受到茉莉酸信号途径调控,我们通过酵母双杂交检验HbICE1与7个橡胶HbJAZ蛋白之间的相互作用,发现HbICE1与其中的HbJAZ1发生互作,说明茉莉酸信号确实可能通过HbJAZ1与ICE1发生互作从而参与低温胁迫响应调控。本研究将有助于解析橡胶树冷胁迫应答的分子机理,为探索橡胶树抗寒机理提供重要的理论意义和经济价值,为后续更好的研究巴西橡胶树的低温胁迫信号通路及分子遗传育种奠定了良好的基础。
【关键词】：巴西橡胶树 HbICE1 表达分析 酵母双杂
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S794.1;Q943.2
【目录】：
- 摘要4-5
- Abstract5-9
- 1 引言9-18
- 1.1 巴西橡胶树的研究背景9
- 1.2 植物对低温胁迫的响应9-13
- 1.2.1 低温胁迫对植物的影响9-10
- 1.2.2 植物对低温胁迫的响应10-13
- 1.3 低温胁迫与其它抗寒相关因子13-14
- 1.4 酵母双杂技术概述14-16
- 1.4.1 酵母双杂交技术的原理14-15
- 1.4.2 酵母双杂交技术的优缺点15-16
- 1.5 本研究的目的及意义16-17
- 1.6 本研究的技术路线17-18
- 2 材料与方法18-35
- 2.1 实验材料与试剂18-19
- 2.1.1 实验材料18
- 2.1.2 酶、试剂及化学药品18-19
- 2.1.3 实验仪器及工具19
- 2.2 实验方法19-35
- 2.2.1 橡胶HbICE1的cDNA全长克隆19-24
- 2.2.2 HbICE1的多序列比对及进化树构建24
- 2.2.3 HbICE1的表达模式分析24-25
- 2.2.4 橡胶HbICE1的亚细胞定位分析25-26
- 2.2.5 HbICE1转基因株系的获得及表达分析26-30
- 2.2.6 HbICE1的自转录活性分析30-31
- 2.2.7 酵母双杂筛选HbICE1的互作蛋白31-33
- 2.2.8 橡胶HbICE1与HbJAZs的互作分析33-35
- 3 结果与分析35-53
- 3.1 橡胶HbICE1的克隆与生物信息学分析35-39
- 3.2 HbICE1在生物及非生物逆境胁迫下的表达模式39-41
- 3.3 HbICE1的亚细胞定位41-42
- 3.4 HbICE1过表达转化拟南芥的初步筛选42-45
- 3.4.1 构建植物表达载体及转化农杆菌42-43
- 3.4.2 HbICE1转基因拟南芥的PCR鉴定43-45
- 3.5 酵母双杂交筛选HbICE1的互作蛋白45-50
- 3.5.1 诱饵载体的构建45
- 3.5.2 转录自激活检测45-47
- 3.5.3 酵母双杂文库滴定检测47
- 3.5.4 HbICE1酵母双杂文库的筛选47-50
- 3.6 HbICE1与HbJAZs的互作分析50-53
- 3.6.1 pGADT7-HbICE1捕获载体的构建50
- 3.6.2 pGBKT7-HbJAZs诱饵载体的自激活检测与互作分析50-53
- 4 讨论53-55
- 5 结论55-56
- 参考文献56-60
- 附录60-66
- 致谢66
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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本文编号：495381
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