日本牙鲆Paralichthys olivaceus核酸内切酶结构域1基因的克隆与表征

发布时间：2017-07-02 09:11

  本文关键词：日本牙鲆Paralichthys olivaceus核酸内切酶结构域1基因的克隆与表征，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)是东亚国家如中国、日本和韩国沿海养殖中重要的鱼种之一。其全球养殖产量在过去20年内呈快速增长。随着养殖业的发展,日本牙鲆在养殖中面临易受病原体感染的严峻挑战。因此,更好的了解其免疫系统有助于对抗其鱼类疾病并促进日本牙鲆养殖业的进一步发展。鱼类免疫系统可分为先天性免疫系统和获得性免疫系统,也可分别称为非特异性免疫系统和特异性免疫系统。先天性免疫系统属于整个免疫系统的亚系统部分,保护机体不受其它生物的感染。它以一种笼统并迅速的方式识别入侵的病原体并对其产生应答。先天性免疫对多细胞生物的生存是至关重要的,但它不能为机体提供长效的保护性免疫。获得性免疫由高度特异性细胞,蛋白和通路组成,为机体提供长效且高度的特异性保护。先天性免疫系统可分为物理、细胞和体液成分。体液成分包括生长抑制因子、分解酶、天然抗体、细胞因子、趋化因子和抗菌肽等。核酸内切酶结构域1(ENDOD1)蛋白是古老的DNA/RNA非特异性核酸酶家族成员之一。该家族的核酸酶已在许多原核和真核生物中被发现,他们拥有以下共同特性:可切割DNA和RNA,即切割双链和单链核酸,且反应需要二价离子如Mg2+的参与。在实验室前期工作中,利用微阵列技术检测了福尔马林杀死的迟钝爱德华氏菌(E.tarda FKC)注射不同时间段后日本牙鲆中各基因的表达情况。其中发现,来自日本牙鲆的ENDOD1基因(Jf_ENDOD1)在E.tarda FKC注射鱼体6h及12h后,与正常鱼体相比,其表达量均有明显提高。因此推测Jf_ENDOD1的表达或许与牙鲆的免疫反应存在一定关系。本研究中,利用RACE-PCR技术扩增得到Jf_ENDOD1的cDNA序列。经分析,其cDNA序列包含一个912bp的开放阅读框,编码303个氨基酸。起始的27个氨基酸被预测为Jf_ENDOD1的一个信号肽序列。成熟的Jf_ENDOD1由276个氨基酸组成,其预测蛋白分子量为32kDa。经比对,日本牙鲆Jf_ENDOD1的氨基酸序列与大黄鱼Larimichthys crocea的预测序列相似度达76%。在Jf_ENDOD1组织分布特异性检测中,发现在所有被检测的健康鱼体组织中,Jf_ENDOD1 mRNA均有少量分布,而在注射E.tarda FKC 6h后的鱼体组织中,Jf_ENDOD1 mRNA在脑、肾、脾和肠组织中大量表达,在腮和皮肤组织中呈中度表达,而在肌肉和肝脏组织中未见明显变化。本研究还利用大肠杆菌Escherichia coli生产Jf_ENDOD1重组蛋白,且经检测,该重组蛋白具有DNase活性。此外,为了评估Jf_ENDOD1蛋白的体内活性,本研究收集了E.tarda FKC注射日本牙鲆12h,24h及72h后脾和肾组织的总蛋白并同时采集相同组织的mRNA。检测发现,注射组的总蛋白DNase活性均高于正常组,且注射组的Jf_ENDOD1 mRNA表达量明显高于正常组,故推测,注射组的总蛋白DNase活性升高源于Jf_ENDOD1表达量升高。
【关键词】：日本牙鲆 免疫反应 核酸酶 ENDOD1
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1.1 日本牙鲆14
• 1.2 鱼类先天性免疫14-20
• 1.3 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）20-21
• 1.4 非特异性核酸内切酶21-23
• 1.5 目的23-24
• 第二章 Jf_ENDOD1 cDNA克隆与序列分析24-34
• 2.1 材料与方法24-28
• 2.1.1 实验材料24
• 2.1.2 总RNA提取24
• 2.1.3 RACE-PCR合成Jf_ENDOD1 cDNA 5’端片段24-25
• 2.1.4 分段测序获得Jf_ENDOD1 cDNA序列25-28
• 2.1.5 Jf_ENDOD1序列分析28
• 2.2 实验结果28-32
• 2.2.1 Jf_ENDOD1基因cDNA克隆及序列分析28-30
• 2.2.2 多重序列比对及系统分析30-32
• 2.3 讨论32-34
• 第三章 Jf_ENDOD1组织分布特异性分析34-38
• 3.1 材料与方法34-35
• 3.1.1 实验材料34
• 3.1.2 总RNA提取34
• 3.1.3 cDNA合成34-35
• 3.1.4 RT-PCR扩增各组织Jf_ENDOD1及内控基因35
• 3.2 实验结果35-36
• 3.3 讨论36-38
• 第四章 Jf_ENDOD1重组质粒构建及蛋白纯化38-45
• 4.1 材料与方法38-43
• 4.1.1 实验材料38
• 4.1.2 重组菌构建38-41
• 4.1.3 重组蛋白纯化及复性41-42
• 4.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白42-43
• 4.1.5 Western-blotting检测重组蛋白43
• 4.2 实验结果43-44
• 4.3 讨论44-45
• 第五章 重组蛋白及鱼总蛋白DNase活性分析45-51
• 5.1 材料与方法45-47
• 5.1.1 实验材料45
• 5.1.2 RT-PCR检测Jf_ENDOD1 mRNA表达量45-46
• 5.1.3 总蛋白提取46
• 5.1.4 DNase活性试验46-47
• 5.2 实验结果47-49
• 5.3 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-69
• 致谢69-70
• 在读期间发表的学术论文及研究成果70

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张玉青;谭训刚;徐們;孙威;徐永立;张培军;;Quantitative comparison of the expression of myogenic regulatory factors in flounder(Paralichthys olivaceus) embryos and adult tissues[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2010年02期

2 谭训刚;张玉青;孙威;张培军;徐永立;;Characterization of flounder (Paralichthys olivaceus) FoxD5 and its function in regulating myogenic regulatory factor[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2012年02期

3 ZANG Xiaonan;ZHANG Xuecheng;MU Xiaosheng;LIU Bin;;Optimization of the Purification Methods for Recovery of Recombinant Growth Hormone from Paralichthys olivaceus[J];Journal of Ocean University of China;2013年01期

4 张之文;孙修勤;张进兴;昝金东;;Cloning and expression of prion protein encoding gene of flounder (Paralichthys olivaceus)[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2008年01期

5 ;Estimates of genetic and phenotypic parameters for weight and length in Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J];Acta Oceanologica Sinica;2011年06期

6 尤锋;张培军;王可玲;相建海;;Genetic variation of natural and cultured stocks of Paralichthys olivaceus by allozyme and RAPD[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2007年01期

7 ;Subcellular localization and inductive expression of the dsRNA-dependent protein kinase PKR from Japanese flounder,Paralichthys olivaceus[J];Progress in Natural Science;2009年10期

8 ;Cytogenetic characterization of olive flounder Paralichthys olivaceus: DNA content, karyotype, AgNORs and location of major ribosomal genes[J];Acta Oceanologica Sinica;2009年04期

9 ;Effects of Calanoid Copepod Schmackeria poplesia as a Live Food on the Growth, Survival and Fatty Acid Composition of Larvae and Juveniles of Japanese Flounder, Paralichthys olivaceus[J];Journal of Ocean University of China;2009年04期

10 ;Analysis of New Microsatellite Markers Developed From Reported Sequences of Japanese Flounder Paralichthys olivaceus[J];Journal of Ocean University of China;2010年04期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 ;The Effect of Temperature and Substrate on Recruitment Patterns of Bastard Halibut,Paralichthys olivaceus (T.et S.)[A];中国海洋与湖沼学会甲壳动物学分会、中国动物学会、中国海洋与湖沼学会生态学分会2000年学术研讨会论文摘要集[C];2000年

2 ;Induction of diploid gynogenesis in southern flounder Paralichthys lethostigma with left-eyed flounder Paralichthys olivaceus sperm[A];江苏省遗传学会第七届二次代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年

3 ;Molecular structure and expression patterns of flounder (Paralichthys olivaceus)Myf-5,a myogenic regulatory factor.[A];中国遗传学会“发育、遗传和疾病”研讨会论文汇编集[C];2007年

4 ;Maturity of Bastard Halibut,Paralichthys olivaceus(T.et S.)in the Coastal Waters of Northern China Seas[A];中国海洋与湖沼学会甲壳动物学分会、中国动物学会、中国海洋与湖沼学会生态学分会2000年学术研讨会论文摘要集[C];2000年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 刘清华;牙鲆Paralichthys olivaceus（♀）×夏鲆Paralichthys dentaus（♂）分子遗传学及数量遗传学研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 吕哲U

本文编号：509281