齐口裂腹鱼GK基因时空表达及其影响初步研究
发布时间:2017-07-03 20:03
本文关键词:齐口裂腹鱼GK基因时空表达及其影响初步研究
【摘要】:葡萄糖激酶(GK)是糖酵解过程中的限速酶,为了更好的了解齐口裂腹鱼GK的分子特点及调控作用,本研究运用RACE技术首次克隆了齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)的GK基因cDNA全序列;运用实时荧光定量PCR技术检测了GK基因在成鱼、产后亲鱼中的组织分布,测定了同一亲本的胚胎及胚后发育过程中GK基因表达时序;研究了不同开口饵料和灌服不同糖对齐口裂腹鱼GK基因表达的影响。齐口裂腹鱼GK基因cDNA全序列共2087bp (GenBank登陆号:KT895594.1),其中5'-UTR为63bp,3'-UTR为593bp,ORF为1431bp,编码476个氨基酸,其中包括1个葡萄糖激酶特有结构域序列、ATP结合位点以及葡萄糖结合位点。齐口裂腹鱼GK的氨基酸序列与鲤鱼(Cyprinus carpio)、彭泽鲫(Carassius auratus var. Pengze)和草鱼(Ctenopharyngodon idella)的同源性分别高达到97.9%、97.3%和96.8%。齐口裂腹鱼GK基因分布具有高度的组织特异性。成鱼的19个组织中,肝胰脏表达量最高,其次为心脏、卵巢和精巢,其余组织表达量很低。产后亲鱼16个组织中也是肝胰脏表达量最高(雌鱼高于雄鱼),但心脏、卵巢和精巢等其余组织表达量极低。繁殖过程对GK基因的组织分布有明显影响。齐口裂腹鱼同一亲本子代的26个胚胎时期和10个胚后时期中,GK基因的表达时序特征分明,且胚后阶段的表达水平总体高于胚胎阶段。GK基因于未受精卵中有表达,至4细胞期(82.2℃·h)时差异不显著,8细胞期(104.7℃·h)时开始上调,到16细胞期(127.5℃·h)时达到最高,然后下降,到囊胚早期(225.3℃·h)其表达量与未受精卵相近,表达量再次上升并于原肠胚早期(684.7℃·h)之后下降,但于心脏原基出现(1619.2℃·h)时表达量出现小高峰,至出膜前期(2154.7℃·h)低于未受精卵表达水平。GK基因表达水平在初孵仔鱼中较低,于循环期(4034.5℃·h)显著增加,到体色素出现期(4406.5℃·h)时又显著下降,此后表达量不断上调,到消化道贯通(6278.5℃·h)时最高,此时仔鱼平游觅食,能量消耗增加,而后GK又开始下调,于鳞片形成时仍高于未受精卵水平。GK基因高表达与胚胎、胚后发育过程中重要器官的形成和高能耗有关。本研究结果可为进一步研究GK基因在齐口裂腹鱼整个生命周期中的作用奠定基础。蛋黄、卤虫卵、微粒饲料对齐口裂腹鱼仔鱼GK酶活力及基因表达的影响出现差异。3d时各饵料组的GK酶活力和基因表达量差异不显著,说明卵黄囊的存在会减小饵料对GK酶活力及基因表达的影响;3d至30d时卤虫卵组和微粒饲料组的GK基因表达量随养殖时间的增加不断提高,而蛋黄组GK基因表达量基本不变(除10d时略高)。仔鱼生长速度快,其GK基因表达量高,并随养殖时伺增加而提高,但基因表达量与酶活力之间未反映出一致关系。灌服葡萄糖和可溶性淀粉后1h时不会影响齐口裂腹鱼肝胰脏中GK的酶活力和基因表达量变化,1h后会诱导二者提高,24h时基本恢复灌服前水平,且葡萄糖效应时间更短,说明24h内鱼体对葡萄糖的糖酵解效率高于可溶性淀粉。灌服葡萄糖会抑制肝胰脏中PEPCK的酶活力和基因表达量,但不会抑制中肾、前肠和后肠中PEPCK基因的表达。本研究结果可为阐明齐口裂腹鱼糖代谢本质提供一定的理论依据。
【关键词】:齐口裂腹鱼 GK基因 时空表达 开口饵料
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4
【目录】:
- 摘要3-5
- Abstract5-8
- 符号说明8-12
- 前言12-13
- 1 文献综述13-26
- 1.1 鱼类糖代谢概况14-18
- 1.1.1 糖代谢主要途径14-15
- 1.1.2 糖代谢主要场所15-16
- 1.1.3 糖代谢能力16-17
- 1.1.4 糖代谢关键酶17-18
- 1.2 鱼类GK基因的研究进展18-24
- 1.2.1 GK的发现与基因克隆18-19
- 1.2.2 GK基因的分布19-20
- 1.2.3 生物学功能与调控20-22
- 1.2.4 糖类对鱼类GK、PEPCK的影响22-24
- 1.2.5 小结24
- 1.3 本研究的目的意义及研究内容24-26
- 1.3.1 目的意义24-25
- 1.3.2 研究内容25-26
- 2 齐口裂腹鱼GK基因cDNA全长序列的克隆26-44
- 2.1 试验材料26-27
- 2.1.1 试验鱼26
- 2.1.2 主要试剂26
- 2.1.3 主要仪器26-27
- 2.1.4 主要试剂配制27
- 2.2 试验方法27-35
- 2.2.1 组织采样27-28
- 2.2.2 总RNA的提取及检测28-29
- 2.2.3 制备cDNA29
- 2.2.4 核心序列的克隆29-32
- 2.2.5 RACE扩增32-34
- 2.2.6 全长序列的拼接34
- 2.2.7 生物信息学分析34-35
- 2.3 试验结果35-43
- 2.3.1 组织总RNA质量检测35
- 2.3.2 GK基因的cDNA全序列35-36
- 2.3.3 氨基酸序列分析36-38
- 2.3.4 同源性和系统进化分析38-43
- 2.4 讨论43-44
- 3 齐口裂腹鱼GK基因的时空表达44-58
- 3.1 试验材料44-45
- 3.1.1 成鱼和产后亲鱼44
- 3.1.2 胚胎44
- 3.1.3 主要试剂44
- 3.1.4 主要仪器44-45
- 3.2 试验方法45-50
- 3.2.1 组织取样45
- 3.2.2 不同发育时期胚胎及仔鱼取样45-48
- 3.2.3 总RNA提取及检测48
- 3.2.4 制备cDNA模板48
- 3.2.5 实时荧光定量PCR48-49
- 3.2.6 数据分析49-50
- 3.3 试验结果50-55
- 3.3.1 引物质量检测结果50-51
- 3.3.2 GK基因在齐口裂腹鱼成鱼、产后亲鱼中的组织分布51-53
- 3.3.3 GK基因在齐口裂腹鱼胚胎及胚后发育过程中的表达情况53-55
- 3.4 讨论55-58
- 3.4.1 GK基因在齐口裂腹鱼成鱼、产后亲鱼中的组织特异性55-57
- 3.4.2 GK基因在齐口裂腹鱼胚胎及胚后发育过程中的表达分析57-58
- 4 不同开口饵料对齐口裂腹鱼GK酶活力及基因表达量的影响58-66
- 4.1 试验材料58-59
- 4.1.1 试验鱼58
- 4.1.2 开口饵料58
- 4.1.3 主要试剂58
- 4.1.4 主要仪器58-59
- 4.2 试验方法59-60
- 4.2.1 饲养管理59
- 4.2.2 试验分组及取样59
- 4.2.3 指标测定59-60
- 4.2.4 数据分析60
- 4.3 试验结果60-62
- 4.3.1 GK酶活力60-61
- 4.3.2 GK基因表达量61-62
- 4.4 讨论62-66
- 4.4.1 不同开口饵料对仔鱼GK酶活力的影响62-64
- 4.4.2 不同开口饵料对仔鱼GK基因表达量的影响64-66
- 5 灌服葡萄糖和可溶性淀粉对GK、PEPCK酶活力及基因表达量的影响66-83
- 5.1 试验材料66
- 5.1.1 试验鱼66
- 5.1.2 主要试剂66
- 5.1.3 主要仪器66
- 5.1.4 主要试剂配制66
- 5.2 试验方法66-68
- 5.2.1 饲养管理66-67
- 5.2.2 试验分组及取样67
- 5.2.3 指标测定67-68
- 5.2.4 数据分析68
- 5.3 试验结果68-78
- 5.3.1 肝糖原68-69
- 5.3.2 GK酶活力69-70
- 5.3.3 PEPCK酶活力70-71
- 5.3.4 GK基因表达量71-73
- 5.3.5 PEPCK基因表达量73-78
- 5.4 讨论78-83
- 5.4.1 不同糖对齐口裂腹鱼肝糖原的影响78-79
- 5.4.2 不同糖对齐口裂腹鱼GK、PEPCK酶活力的影响79-80
- 5.4.3 不同糖对齐口裂腹鱼GK、PEPCK基因表达量的影响80-83
- 6 主要结论83-84
- 参考文献84-93
- 致谢93-94
- 攻读学位期间完成的学术成果目录94
【参考文献】
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本文编号:514972
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