基于HPV18 E6E7基因的治疗性疫苗的构建及免疫原性研究

发布时间：2017-07-03 20:16

  本文关键词：基于HPV18 E6E7基因的治疗性疫苗的构建及免疫原性研究

  更多相关文章： HPV18 E6E7 重组腺病毒疫苗 DC疫苗 CRISPR/Cas9系统

【摘要】：人乳头瘤病毒是无包膜闭环双链DNA病毒,许多癌症如子宫颈癌、食管癌等的发生和发展都与HPV的感染有一定的关系。HPV目前已知有两百多种亚型,大量研究发现:高危型HPV16、HPV18在宫颈癌和食管癌病变组织中最为常见。HPV中的E6和E7是主要致癌蛋白,通过影响细胞周期、细胞凋亡等方面使宿主细胞永生化并恶性转化。已发现E6、E7蛋白在大多数肿瘤组织及癌前病变组织中持续表达,在正常组织中却不表达,因此E6、E7蛋白可被选择作为发展HPV相关肿瘤治疗性疫苗的理想靶抗原。但是E6、E7基因属于癌基因,直接用作抗原基因构建治疗性疫苗,存在较大程度的安全性隐患。已有大量研究表明,通过对癌基因E6、E7关键位点进行密码子突变,可以降低甚至消除E6、E7基因的致癌性,从而提高E6、E7蛋白作为治疗性疫苗靶抗原的安全性。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是免疫系统中目前所知的功能最强大的抗原提呈细胞,捕捉抗原,通过MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两种途径将抗原递交给T细胞,从而激活T细胞,诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。国内外已有大量关于DC疫苗的应用报道。本研究首先构建携带HPV18 E6E7野生型基因的重组腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7-0及其DC疫苗,携带HPV18 E6E7优化融合突变基因的重组腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7-3及其DC疫苗(其中对E6第138位氨基酸和E7第98位氨基酸进行突变,即C138G和C98G),然后免疫小鼠,获取T淋巴细胞,用ELISPOT技术检测各疫苗组的细胞免疫原性。结果显示基于HPV18 E6E7基因治疗性疫苗可以产生显著的细胞免疫效果,从而为进一步开发HPV18相关肿瘤治疗性疫苗打下基础。最后本研究构建了重组慢病毒载体质粒LentiCRISPR-v2-HPV16/18 E6E7,期望通过CRISPR/Cas9系统敲除HPV 16/18 E6E7基因,探索一种靶向治疗HPV相关肿瘤的新型方法。
【关键词】：HPV18 E6E7 重组腺病毒疫苗 DC疫苗 CRISPR/Cas9系统
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 主要英文缩写词6-10
• 第1章 绪论10-20
• 1.1 HPV研究背景10-13
• 1.1.1 HPV分子特点10-11
• 1.1.2 HPV与肿瘤的关系11-12
• 1.1.3 HPV致癌机制12-13
• 1.2 HPV相关肿瘤的治疗13-17
• 1.2.1 肿瘤治疗的传统方法13-14
• 1.2.2 肿瘤治疗新技术14-16
• 1.2.3 CRISPR/Cas9在HPV相关肿瘤治疗中的应用前景16-17
• 1.3 课题研究内容17-20
• 1.3.1 携带HPV18 E6E7基因的腺病毒疫苗及DC疫苗的构建及免疫原性研究17-18
• 1.3.2 CRISPR/Cas9敲除HPV16/18 E6E7基因的质粒构建18-20
• 第2章 携带HPV18 E6E7基因的腺病毒疫苗及DC疫苗的构建及免疫原性研究20-38
• 2.1 引言20
• 2.2 实验材料20-22
• 2.2.1 实验试剂20-21
• 2.2.2 实验设备21
• 2.2.3 菌株和质粒21-22
• 2.2.4 细胞株22
• 2.2.5 实验动物22
• 2.3 实验方法22-32
• 2.3.1 重组腺病毒疫苗rAd-HPV18 E6E7的制备22-28
• 2.3.2 树突状细胞疫苗DC-HPV18 E6E7的制备28-29
• 2.3.3 重组腺病毒疫苗及树突状细胞疫苗的免疫原性检测29-32
• 2.4 实验结果32-36
• 2.4.1 穿梭质粒pDC315-HPV18 E6E7酶切鉴定32
• 2.4.2 骨架质粒pBH Glox E1△\3 cre的酶切鉴定结果32-33
• 2.4.3 检测重组腺病毒疫苗E6E7的表达33
• 2.4.4 纯化重组腺病毒的滴度测定33-34
• 2.4.5 重组腺病毒感染DC的条件34-35
• 2.4.6 Western Blot检测树突状细胞疫苗E6E7表达35
• 2.4.7 ELISPOT检测细胞免疫反应35-36
• 2.5 讨论36
• 2.6 本章小结36-38
• 第3章 CRISPR/Cas9敲除HPV 16/18 E6E7基因的质粒构建38-48
• 3.1 引言38
• 3.2 实验材料38-39
• 3.2.1 实验设备38-39
• 3.2.2 菌株和质粒39
• 3.2.3 工具和内切酶39
• 3.3 实验方法39-42
• 3.3.1 gRNA序列的设计与合成39-40
• 3.3.2 寡核苷酸退火连接40
• 3.3.3 载体质粒lentiCRISPR-V2酶切及胶回收40-41
• 3.3.4 连接目的片段与载体41
• 3.3.5 连接产物的转化41
• 3.3.6 连接产物的提取及鉴定41-42
• 3.4 实验结果42-45
• 3.4.1 慢病毒质粒lentiCRISPR-V2酶切结果42
• 3.4.2 慢病毒质粒lentiCRISPR-V2胶回收结果42
• 3.4.3 重组质粒测序鉴定结果42-45
• 3.5 讨论45
• 3.6 本章小结45-48
• 结论48-50
• 参考文献50-56
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文56-58
• 致谢58

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