禽源肠炎沙门氏菌PmrB基因突变介导粘菌素耐药机制研究

发布时间：2017-07-05 01:00

  本文关键词：禽源肠炎沙门氏菌PmrB基因突变介导粘菌素耐药机制研究

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【摘要】：禽源肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,可以通过食源性途径传染给人类。粘菌素(colistin)是一种常见的多肽类抗生素,目前是用于治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染最后的选择。耐粘菌素肠炎沙门氏菌的出现及传播给多重耐药革兰氏阴性菌的治疗带来了极大的威胁。有研究表明Pmr A/PmrB二元调控系统对革兰氏阴性菌粘菌素耐药的产生起到重要的作用。本实验室成功诱导出耐粘菌素肠炎沙门氏菌,对其PmrA、PmrB基因进行测序,发现PmrB发生了不同于已有报道的突变,Pmr A基因并无变化。本研究在此发现的基础上利用Red同源重组及I-Sce?酶构建相应的PmrB无痕突变菌株,研究突变前后菌株对粘菌素最小抑菌浓度(MIC),和粘菌素耐药相关基因表达量变化,有助于了解禽源肠炎沙门氏菌Pmr A/PmrB突变对粘菌素耐药的机制。主要的研究内容及结果如下:利用粘菌素在2-12(32)菌株的基础上继续诱导耐药,获得2-12(512),利用高通量测序技术对2-12和2-12(512)菌株进行全基因组测序。2-12和2-12(512)全基因组测序后进行同源分析得2-12有5个特有蛋白,2-12(512)有9个特有蛋白;单核苷酸多态性(SNP)分析得2-12(512)与2-12比较有30个SNP位点。在辅助质粒pKD46-rha-IS表达的Red同源重组系统及I-Sce?酶的作用下,利用基因突变重组片段197-cat-sacB、249-cat-sacB无痕且快速对肠炎沙门氏菌PmrB基因进行突变,成功获得了沙门氏菌PmrB基因突变株。测定构建的PmrB基因缺失及点突变菌株对多种抗菌药物(包括粘菌素)的MIC值,结果表明,突变后菌株对粘菌素的MIC值均为16μg/mL,是2-12敏感菌株粘菌素MIC的8倍。2-12ΔPIA与敏感菌相比对十二种常见抗生素敏感性无明显变化;2-12D149N和2-12相比,庆大霉素(GM)MIC值提高160倍,大观霉素(SPT)MIC值降低64倍,其余抗生素无明显变化。通过实时荧光定量PCR反应,测定肠炎沙门氏菌2-12、2-12ΔPIA、2-12 D149N、2-12(32)、2-12(512)、GD1-13、GD1-14与粘菌素耐药相关的基因PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH在mRNA水平上的表达量。结果显示PmrB突变显著的促进了PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH基因的表达。
【关键词】：肠炎沙门氏菌 禽 PmrA/PmrB 同源重组 粘菌素
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 英文缩略词或符号表6-9
• 1 前言9-18
• 1.1 粘菌素概述9
• 1.2 粘菌素结构介绍9-10
• 1.3 粘菌素的作用机理10-11
• 1.4 沙门氏菌PmrA/PmrB二元调控系统概述11-12
• 1.5 PmrA/PmrB二元调控系统与粘菌素耐药12-14
• 1.6 λRed重组14-17
• 1.7 本研究目的意义17-18
• 2 材料与方法18-36
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-21
• 2.2.1 菌株与质粒18
• 2.2.2 主要试剂18-19
• 2.2.3 主要培养基及试剂的配制19-20
• 2.2.4 主要仪器20-21
• 2.2.5 引物设计与合成21
• 2.3 方法21-36
• 2.3.1 测定诱导耐药保存菌株的MIC值并继续诱导耐药21-22
• 2.3.2 对 2-12和 2-12（512）沙门氏菌进行全基因组测序22-23
• 2.3.3 重组片段的构建23-29
• 2.3.4 pKD46-rha-IS质粒的构建29-30
• 2.3.5 重组菌株的构建30-32
• 2.3.6 PmrB突变菌株粘菌素MIC测定32
• 2.3.7 PmrB突变菌株对12种常见抗菌药的敏感性测定32-33
• 2.3.8 PmrA、PmrB基因及关联基因的表达情况33-36
• 3 结果36-49
• 3.1 保存菌株的MIC值36
• 3.2 全基因组测序初步分析36-37
• 3.3 PCR扩增重组片段37-39
• 3.3.1 cat及sacB基因扩增37-38
• 3.3.2 cat和sacB融合PCR结果38-39
• 3.4 pKD46-rha-IS质粒的构建39-40
• 3.4.1 片段rha-IS的PCR扩增39
• 3.4.2 pKD46质粒用NcoI单酶切39
• 3.4.3 rha-IS片段和线性化pKD46做无缝克隆39-40
• 3.5 重组菌株的构建40-44
• 3.5.1 质粒pKD46-rha-IS电转入 2-12鉴定40-41
• 3.5.2 第一次重组菌株鉴定41-42
• 3.5.3 第二次重组菌鉴定42-44
• 3.5.4 重组菌株丢失pKD46-rha-IS质粒44
• 3.6 粘菌素最小抑菌浓度测定44-45
• 3.7 PmrB突变菌株对12种常见抗菌药的敏感性45
• 3.8 PmrB及其关联基因表达量情况45-49
• 4 讨论49-52
• 4.1 突变位点的确认49
• 4.2 突变菌株的构建49-50
• 4.3 突变菌株对抗生素敏感性变化50
• 4.4 基因表达量变化50-52
• 全文总结52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-57

【参考文献】

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1 董浩;吴清民;;布鲁菌二元调控系统研究进展[J];动物医学进展;2013年08期

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本文编号：519897