青稞F7-OMT基因的克隆及表达分析

发布时间：2017-07-05 04:11

  本文关键词：青稞F7-OMT基因的克隆及表达分析

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【摘要】：青稞是青藏高原最有特色的作物,遗传类型丰富多样,具有“三高两低”(高纤维、高蛋白、高维生素和低糖、低脂肪)的结构组成和优良的医疗保健功能。其类黄酮和β-葡聚糖等营养物质丰富且显著高于普通大麦。其中类黄酮化合物与其生殖生长、生态防御、抗胁迫、抗病菌等密切相关。F7-OMT (Flavonoid 7-O-methyltransferase)能催化底物类黄酮苯环上的一个或多个羟基甲基化产生氧甲基类黄酮。使类黄酮具有更强的脂溶性,更有利于在细胞内的扩散,提高植物的抗逆性；还能通过提高人体中的口服利用率,从而产生更强抗病、抗癌、调节糖脂代谢、保护心脑血管及神经系统的作用。本研究以青稞“94-19-1”为材料,采用同源克隆和TA克隆的方法得到大量青稞F7-OMT基因片段,并进行生物信息学分析；通过亚克隆构建融合表达载体,对其诱导表达、优化表达条件,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白；通过实时荧光定量PCR技术对F7-OMT在青稞和大麦高、低黄酮材料“94-19-1”、“肚里黄”、“扬农啤6号”和“红06-277”在UV和盐胁迫处理下表达状况进行了相对定量分析。旨在为进一步研究该酶蛋白功能和选育高抗性、高保健作用的青稞品种奠定基础。主要结果如下：1.通过同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因并进行生物信息学分析表明：cDNA全长为1284 bp,其中包含开放阅读框1173 bp。碱基分布均匀,密码子偏爱性不强,有20个稀有密码子,GC含量不高,为53.03%。编码390个氨基酸,蛋白分子质量42207.8Da,分子式C1878H2977N497O562S22,等电点pI为5.36。在280 nm处摩尔消光系数为28420,半衰期为30 h,不稳定系数为40.69,属于不稳定蛋白。脂肪系数为96.49,总平均亲水性系数为0.127,属于疏水性蛋白。无信号肽序列,无跨膜结构,但含有丰富的糖基化、磷酸化位点和3个二硫键。具有Methyltransf_2和Dimerization保守域,其His296为接受质子的活性位点,而Asp258为SAM结合位点。通过NCBI-blastp同源序列比对发现OMT家族蛋白序列保守性较低,但在青稞F7-OMT氨基酸序列中His296对应的组氨酸高度保守。系统发育树分析表明,该蛋白与单子叶植物OMT归为一类,与双子叶OMT在进化上有明显区分,但其保守性没有异黄酮O-甲基转移酶(IOMT)强,7-OMT家族并不是非常保守。2.通过亚克隆将F7-OMT基因连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT1融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中经IPTG诱导表达,得到约60 kDa融合蛋白,同时通过时间及IPTG终浓度梯度优化表达。并按IPTG浓度0.8 mmol/L、5 h条件诱导其蛋白大量表达,从而采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。3.采用相对荧光定量分析方法,以大麦组成型表达基因β-actin作为内参,检测到经紫外线照射后,高黄酮含量青稞“94-19-1”和大麦“扬农啤6号”的叶中高水平表达,且前者显著高于后者,后者根中也有一定量的表达。经NaCl处理的材料叶、根中均发现表达水平极低。未经处理的“94-19-1”叶中表达量不高,但其他材料却表达量极低。
【关键词】：大麦 青稞 F7-OMT基因 克隆 原核表达分析 荧光定量分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S512.3;Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 文献综述13-28
• 1 青稞概述13-14
• 2 类黄酮概述14-16
• 2.1 基本结构14
• 2.2 功能14-15
• 2.3 分类15-16
• 3 植物氧甲基转移酶(OMT)概述16-18
• 3.1 特点和功能16
• 3.2 分类16-18
• 3.2.1 按作用底物分类16-17
• 3.2.2 按分子量分类17-18
• 4 类黄酮氧甲基转移酶(FOMT)概述18-25
• 4.1 催化机理18-21
• 4.1.1 底物选择性18
• 4.1.2 结构域18-19
• 4.1.3 与底物结合模式19-20
• 4.1.4 转移甲基原理20-21
• 4.2 基本功能21-24
• 4.2.1 对植物的作用21-22
• 4.2.2 对动物及人体的作用22-24
• 4.3 类黄酮7-氧甲基转移酶(F7-OMT)研究进展24-25
• 5 研究技术路线、目的与意义25-28
• 5.1 技术路线25-26
• 5.2 目的与意义26-28
• 第二章 青稞F7-OMT基因克隆及生物信息学分析28-59
• 1 材料与方法28-38
• 1.1 材料28-30
• 1.1.1 植物材料28
• 1.1.2 菌株与载体28
• 1.1.3 主要试剂28
• 1.1.4 主要试剂配方28-29
• 1.1.5 主要仪器29-30
• 1.2 方法30-38
• 1.2.1 RNA提取30-31
• 1.2.2 RNA检测31
• 1.2.2.1 浓度及纯度测定31
• 1.2.2.2 完整性检测31
• 1.2.3 cDNA第一链合成31-32
• 1.2.4 青稞F7-OMT基因的获得32-33
• 1.2.4.1 引物设计32
• 1.2.4.2 PCR扩增32-33
• 1.2.5 TA克隆33-35
• 1.2.5.1 目的片段的回收33-34
• 1.2.5.2 目的片段与载体连接34
• 1.2.5.3 连接载体的转化34-35
• 1.2.5.4 阳性筛选35
• 1.2.6 生物信息学分析35-38
• 1.2.6.1 碱基序列分析35
• 1.2.6.2 CDS区密码子分析35-36
• 1.2.6.3 氨基酸序列比对及保守域预测36
• 1.2.6.4 系统发育树分析36
• 1.2.6.5 化性质分析36
• 1.2.6.6 二级结构预测36-37
• 1.2.6.7 信号肽预测37
• 1.2.6.8 跨膜结构预测37
• 1.2.6.9 糖基化及磷酸化位点预测37
• 1.2.6.10 二硫键预测37
• 1.2.6.11 细胞定位37
• 1.2.6.12 三级结构分析37-38
• 2 结果与分析38-55
• 2.1 总RNA浓度与纯度检测38-39
• 2.2 cDNA全长获得39
• 2.3 重组质粒菌液检测39
• 2.4 生物信息学分析39-55
• 2.4.1 碱基序列分析39-42
• 2.4.2 CDS区密码子分析42-44
• 2.4.3 氨基酸序列比对及保守域预测44-46
• 2.4.4 系统发育树分析46-47
• 2.4.5 理化性质分析47-48
• 2.4.6 二级结构预测48-49
• 2.4.7 信号肽预测49
• 2.4.8 跨膜结构预测49-50
• 2.4.9 糖基化及磷酸化位点预测50-52
• 2.4.10 二硫键预测52-53
• 2.4.11 细胞定位53
• 2.4.12 三级结构分析53-55
• 3 讨论55-59
• 3.1 青稞F7-OMT基因克隆55-56
• 3.2 生物信息学分析56-59
• 3.2.1 碱基序列及密码子分析56
• 3.2.2 氨基酸序列及保守域分析56-57
• 3.2.3 系统发育树分析57-58
• 3.2.4 蛋白性质结构分析58-59
• 第三章 青稞F7-OMT基因的原核表达59-74
• 1 材料与方法59-67
• 1.1 材料59-61
• 1.1.1 质粒与菌株59
• 1.1.2 主要试剂59
• 1.1.3 主要试剂配方59-60
• 1.1.4 主要仪器60-61
• 1.2 方法61-67
• 1.2.1 带双酶切位点基因的获得61
• 1.2.1.1 双酶切引物设计61
• 1.2.1.2 PCR扩增61
• 1.2.2 带双酶切位点基因的TA克隆61-62
• 1.2.3 原核表达系统的建立62-64
• 1.2.3.1 pMD19-T-F7-OMT1和pET-32a质粒提取62
• 1.2.3.2 pMD19-T-F7-OMT1质粒与pET-32a载体双酶切62-63
• 1.2.3.3 酶切产物回收纯化63
• 1.2.3.4 F-OMT与pET-32a载体连接63
• 1.2.3.5 重组子转化E.coli DH5α63-64
• 1.2.3.6 重组子筛选64
• 1.2.3.7 pET-32a-F7-OMT1质粒提取64
• 1.2.3.8 pET-32a-F7-OMT1质粒转化64
• 1.2.4 重组蛋白的融合表达64-66
• 1.2.4.1 IPTG诱导表达64-65
• 1.2.4.2 SDS-PAGE电泳检测65-66
• 1.2.5 重组蛋白的亲和层析纯化66-67
• 2 结果67-72
• 2.1 重组子双酶切检测67-69
• 2.1.1 pMD19-T-F7-OMT1双酶切检测67
• 2.1.2 pET-32a-F7-OMT1双酶切检测67-69
• 2.2 融合表达分析69-71
• 2.2.1 IPTG诱导浓度梯度69-70
• 2.2.2 诱导表达时间梯度70-71
• 2.3 蛋白纯化71-72
• 3 讨论72-74
• 3.1 原核表达目的与意义72
• 3.2 表达系统选择及条件优化72-73
• 3.3 蛋白纯化分析73-74
• 第四章 青稞F7-OMT基因相对定量分析74-82
• 1 材料与方法74-78
• 1.1 材料74-75
• 1.1.1 植物材料74
• 1.1.2 主要试剂74
• 1.1.3 主要试剂配制74
• 1.1.4 主要仪器74-75
• 1.2 方法75-78
• 1.2.1 植物材料水培75
• 1.2.2 植物材料处理75
• 1.2.3 RNA的提取75
• 1.2.4 第一链cDNA合成75-76
• 1.2.5 实时荧光定量PCR76-77
• 1.2.5.1 引物设计76-77
• 1.2.5.2 实时荧光定量PCR77
• 1.2.6 相对定量分析77-78
• 2 结果与分析78-80
• 2.1 融解曲线分析78-79
• 2.2 相对定量分析79-80
• 3 讨论80-82
• 参考文献82-92
• 致谢92-93
• 攻读硕士期间发表的学术论文93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：520457