牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及缺失株的构建

发布时间：2017-07-14 03:19

  本文关键词：牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及缺失株的构建

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【摘要】：牛支原体是牛呼吸系统的常见病原微生物,除导致牛呼吸系统严重疾病外,还可引起关节炎、角膜炎等一系列次生机能障碍。二氢硫辛酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体重要组成部分,在生物体的能量代谢途径中发挥重要作用,但目前关于牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶的相关研究较为少见。因此,开展牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶相关的研究以期在丰富牛支原体研究内容的同时,也能极大地促进牛支原体相关诊断试剂和疫苗的开发。1.牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶的原核表达及其多克隆抗体的制备参照GeneBank中牛支原体PG45株中的pdhd基因序列设计一对特异性引物,通过PCR扩增获得牛支原体武威株pdhd基因并将其克隆至pMD19-T载体,在序列测定的基础上以Overlap PCR完成基因优化后,与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-pdhd,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后成功获得融合蛋白His-DLD,再经SDS-PAGE电泳鉴定为上清表达;纯化后的表达产物His-DLD免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,并通过ELISA检测抗体效价。结果表明,重组融合蛋白His-DLD多抗血清与纯化后的原核表达产物His-DLD可发生特异性结合反应。2.重组蛋白二氢硫辛酸脱氢酶比活性的测定应用连续监测法对pdhd基因原核表达产物His-DLD的酶促活性进行了测定,结果表明表达产物His-DLD在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,具有二氢硫辛酸脱氢酶活性,其最适反应温度为25℃、pH为7.5;双倒数作图法求出其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率(V max)为25.6μmol/(L·min)。3.牛支原体pdhd基因缺失株的构建从牛支原体武威株基因组扩增pdhd基因的上下游同源臂,通过Overlap PCR与含启动子的庆大霉素抗性基因(Genr)融合,再与pUC19载体连接,构建重组缺失质粒pUC△pdhd。将重组质粒pUC△pdhd电转化导入牛支原体武威株感受态细胞中,在庆大霉素抗性压力筛选下,重组质粒pUC△pdhd与野生株的染色体发生了同源重组,Genr基因取代pdhd基因,从而获得牛支原体pdhd基因缺失株。本研究结果可为深入研究牛支原体的能量代谢及二氢硫辛酸脱氢酶的其他生物学功能提供科学依据,也为进一步深入探索牛支原体的致病机理奠定基础。
【关键词】：牛支原体 二氢硫辛酸脱氢酶 酶活性 基因缺失
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-6
• 外文缩略语表6-11
• 第一部分 文献综述11-19
• 第一章 牛支原体、二氢硫辛酸脱氢酶及基因敲除的研究进展11-19
• 1 牛支原体及牛支原体相关疾病的研究进展11-14
• 1.1 牛支原体的形态及生物学特性11-12
• 1.2 牛支原体病的流行病学特点12
• 1.3 牛支原体病的临床症状12-13
• 1.4 牛支原体病的病理变化13
• 1.5 牛支原体病的诊断13
• 1.5.1 病原学诊断13
• 1.5.2 血清学诊断13
• 1.5.3 分子生物学诊断13
• 1.6 牛支原体病的防治13-14
• 2 二氢硫辛酸脱氢酶研究进展14-16
• 2.1 丙酮酸脱氢酶复合体与二氢硫辛酸脱氢酶14
• 2.2 二氢硫辛酸脱氢酶的组成结构14
• 2.3 二氢硫辛酸脱氢酶的催化机理14-15
• 2.3.1 α-酮酸脱氢酶复合体中二氢硫辛酸脱氢酶的催化机制14-15
• 2.3.2 二氢硫辛酸脱氢酶在甘氨酸裂解系统（GCS）中的催化机理15
• 2.4 二氢硫辛酸脱氢酶的功能与临床意义15-16
• 2.5 牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶16
• 3 基因敲除及同源重组的原理16-18
• 3.1 基因重组载体的构建17
• 3.2 胚胎干细胞的获得17
• 3.3 同源重组17
• 3.4 击中细胞的筛选17
• 3.5 表型研究17
• 3.6 纯合体的获得17-18
• 4 本研究的目的和意义18-19
• 第二部分 试验研究19-42
• 第二章 牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆及原核表达19-28
• 1 材料19-21
• 1.1 试验动物、菌种与载体19
• 1.2 仪器19-20
• 1.3 试剂20-21
• 1.3.1 主要试剂20
• 1.3.2 试剂配制20-21
• 1.3.3 培养基配制21
• 2 方法21-25
• 2.1 引物设计21
• 2.2 牛支原体基因组的提取21-22
• 2.3 牛支原体pdhd基因的克隆22
• 2.4 牛支原体pdhd基因的优化22-23
• 2.5 原核表达载体p ET-pdhd的构建23-24
• 2.6 pdhd基因的原核表达和蛋白纯化24
• 2.6.1 pdhd基因原核表达形式的确定24
• 2.6.2 pdhd基因原核表达的优化24
• 2.6.3 His-DLD蛋白的纯化及定量24
• 2.7 兔抗His-DLD多抗的制备24-25
• 2.7.1 动物免疫24-25
• 2.7.2 多克隆抗体效价的检测25
• 3 结果25-27
• 3.1 pdhd基因的克隆及原核表达载体的构建25-26
• 3.2 His-DLD原核表达及表达产物的纯化26
• 3.3 多克隆抗体效价的检测26-27
• 4 讨论27-28
• 第三章 牛支原体pdhd基因原核表达产物酶活性的测定28-34
• 1 材料28-29
• 1.1 仪器28
• 1.2 试剂28-29
• 1.2.1 主要试剂28
• 1.2.2 试剂配制28-29
• 2 方法29-30
• 2.1 His-DLD比活性的测定30
• 2.2 不同温度对His-DLD活性的影响30
• 2.3 不同p H对His-DLD活性的影响30
• 2.4 不同底物浓度对His-DLD活性的影响30
• 3 结果30-32
• 3.1 His-DLD酶促活性30-31
• 3.2 温度对His-DLD酶促活性的影响31
• 3.3 p H对His-DLD酶促活性的影响31-32
• 3.4 His-DLD的米氏常数及最大反应速率32
• 4 讨论32-34
• 第四章 牛支原体pdhd基因缺失株的构建34-42
• 1 材料34-35
• 1.1 菌种与载体34
• 1.2 仪器34
• 1.3 试剂34-35
• 1.3.1 主要试剂34
• 1.3.2 试剂配制34-35
• 2 方法35-38
• 2.1 试验原理35
• 2.2 庆大霉素MIC的测定35
• 2.3 引物设计35-36
• 2.4 上下游同源臂及庆大基因的克隆36-37
• 2.5 重组缺失质粒pUC△pdhd的构建37
• 2.6 电转化37-38
• 2.7 基因缺失株的初步鉴定38
• 3 结果38-41
• 3.1 庆大霉素MIC测定结果38-39
• 3.2 pdhd基因上下游同源臂及庆大基因的扩增39
• 3.3 缺失质粒pUC△pdhd的构建39-40
• 3.4 突变菌株的获得40
• 3.5 牛支原体pdhd基因缺失株的初步鉴定40-41
• 4 讨论41-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 作者简介50-51
• 导师简介51-53

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