中国野生山葡萄VaERD15基因的功能验证

发布时间：2017-07-17 14:21

  本文关键词：中国野生山葡萄VaERD15基因的功能验证

  更多相关文章： 中国野生山葡萄 红地球葡萄 拟南芥 抗寒性 VaERD15 转基因 功能验证

【摘要】：葡萄在全国乃至全世界都有很广泛的种植。目前全球普遍种植且品质优良的葡萄品种多属欧亚种(Vitis vinifera),但是其抗寒性较差,不适应于我国北方寒冷地区种植。中国野生山葡萄(Vitis amurensis)是葡萄属中抗寒性最强的种,可耐-40℃的低温。如果能将欧亚种葡萄的优良性状与山葡萄的抗寒性结合起来,培育抗寒优质的葡萄新品种,将会扩大葡萄的种植范围。研究中国野生山葡萄抗寒相关基因,并将其转入欧亚种葡萄进行分子育种,是培育抗寒优质葡萄新品种的重要途径。本研究将从野生山葡萄中扩增获得的VaERD15基因分别导入哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)和欧亚种葡萄品种‘红地球’(Vitis vinifera cv.Red Globe),获得了转基因植株,然后对其进行低温胁迫处理,并以未转基因植株为对照,取叶片分别进行分子检测、表型观察及生理指标测定,通过比较与分析,进行了VaERD15基因功能的初步验证。取得的具体结果如下:1.转VaERD15基因拟南芥抗寒性检测(1)利用农杆菌介导法将VaERD15基因转入野生型拟南芥,通过PCR检测和Southern blot检测筛选出转基因拟南芥植株,然后进行实时荧光定量PCR分析和Western blot分析其在低温胁迫下的表达模式。结果表明,随着低温处理时间增加,转基因拟南芥中VaERD15基因的表达量也随之增加,而野生型拟南芥中没有相关表达。(2)通过对低温处理下转基因和野生型拟南芥表型变化观察发现,随着低温胁迫时间延长,野生型拟南芥大部分有严重冻害发生,而转基因拟南芥只有少数轻度冻害发生。(3)对转基因拟南芥和野生型分别测定与抗寒性有关的生理生化指标,包括相对电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛以及超氧化物歧化酶、超氧化物酶和过氧化氢酶三种酶活性等,发现转基因拟南芥上述各项指标明显优于野生型拟南芥。2.转VaERD15基因红地球葡萄抗寒性检测(1)通过农杆菌介导法将VaERD15基因转入欧亚种葡萄品种‘红地球’原胚团(PEM)中,通过含有除草剂(basta)的培养基筛选,并对筛选出的植株进行PCR检测和进一步的Southern blot检测,最终获得转基因株系10个。(2)对获得的‘红地球’葡萄转基因株系进行扩繁,然后选取两个长势相近的株系进行低温处理,取叶片进行实时荧光定量PCR和Western blot检测,结果显示,低温处理时间越长,VaERD15基因表达量也随之增加,且转基因‘红地球’葡萄的表达量明显高于对照。(3)对转基因‘红地球’葡萄和未转基因植株分别测定与抗寒性有关的生理生化指标,包括相对电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛以及超氧化物歧化酶、超氧化物酶和过氧化氢酶三种酶活性等,发现转基因‘红地球’葡萄各项指标优于未转基因植株。以上结果表明,在低温胁迫下,与野生型相比,转VaERD15基因的拟南芥和‘红地球’植株均表现出更强的耐寒性,因此说明来自中国野生山葡萄的转录因子基因VaERD15在山葡萄的抗寒过程中发挥着重要作用。
【关键词】：中国野生山葡萄 红地球葡萄 拟南芥 抗寒性 VaERD15 转基因 功能验证
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S663.1
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstrac8-13
• 第一章 文献综述13-22
• 1.1 植物的抗寒性13-17
• 1.1.1 植物抗寒机理13-15
• 1.1.2 葡萄抗寒性研究进展15-17
• 1.2 脱水诱导早期应答（ERD）基因的研究进展17-18
• 1.3 植物转基因技术研究进展18-22
• 1.3.1 植物转基因技术发展历史及现状18-19
• 1.3.2 植物转基因的方法19-22
• 第二章 农杆菌介导的VaERD15基因转化拟南芥的研究22-28
• 2.1 材料和试剂22
• 2.1.1 试验材料22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.2 方法22-24
• 2.2.1 农杆菌介导的拟南芥转化22-23
• 2.2.2 转基因拟南芥的筛选及分子检测23
• 2.2.3 转基因与野生型拟南芥低温处理并观察表型变化23-24
• 2.2.4 转基因拟南芥低温胁迫下表达水平的分析24
• 2.3 结果与分析24-28
• 2.3.1 转基因拟南芥的分子检测24-26
• 2.3.2 转基因与野生型拟南芥低温胁迫下的表型变化26
• 2.3.3 转基因拟南芥植株中VaERD15基因在低温胁迫下表达水平的变化26-28
• 第三章 农杆菌介导的VaERD15基因转化‘红地球’葡萄的研究28-34
• 3.1 材料和试剂28
• 3.1.1 试验材料28
• 3.1.2 主要试剂28
• 3.1.3 主要仪器设备28
• 3.2 方法28-30
• 3.2.1 农杆菌介导的VaERD15基因转化‘红地球’葡萄28-29
• 3.2.2 转VaERD15基因‘红地球’葡萄的分子检测29-30
• 3.2.3 转基因‘红地球’植株中VaERD15基因在低温胁迫下表达水平的变化30
• 3.3 结果与分析30-34
• 3.3.1 转基因‘红地球’葡萄的筛选、继代、成苗与炼苗30-31
• 3.3.2 转基因‘红地球’葡萄的PCR检测31
• 3.3.3 转基因‘红地球’葡萄的Southern blot检测31-32
• 3.3.4 转基因‘红地球’植株中VaERD15基因在低温胁迫下表达水平的变化32-34
• 第四章 转基因植株低温胁迫下多个生理指标的测定34-44
• 4.1 材料和试剂34
• 4.1.1 试验材料34
• 4.1.2 主要试剂34
• 4.1.3 主要仪器34
• 4.2 试验方法34-37
• 4.2.1 取样34
• 4.2.2 电导率测定34-35
• 4.2.3 游离脯氨酸测定35
• 4.2.4 丙二醛测定35
• 4.2.5 可溶性蛋白质测定35
• 4.2.6 可溶性糖测定35-36
• 4.2.7 抗氧化酶活性的测定36-37
• 4.3 结果和分析37-44
• 4.3.1 电导率的测定结果37-38
• 4.3.2 游离脯氨酸的测定结果38-39
• 4.3.3 丙二醛的测定结果39-40
• 4.3.4 可溶性蛋白质的测定结果40-41
• 4.3.5 可溶性糖的测定结果41-42
• 4.3.6 抗氧化酶的测定结果42-44
• 第五章 讨论44-46
• 5.1 关于葡萄试验材料的选择44
• 5.2 关于转基因植株的筛选与检测44
• 5.3 关于低温胁迫与VaERD15基因表达的关系44-45
• 5.4 VaERD15基因与葡萄抗寒性的关系45-46
• 第六章 结论46-47
• 参考文献47-53
• 致谢53-54
• 作者简介54

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 覃继才;;野生山葡萄扦插育苗技术[J];农家之友;2001年02期

2 王亚娟;何晓亮;;野生山葡萄扦插育苗及栽培技术[J];民营科技;2008年12期

3 张艳玲;韩恒光;高昌菊;;野生山葡萄扦插育苗及栽培技术[J];北方园艺;2008年03期

4 覃继才;;野生山葡萄引种技术[J];农家科技;2009年09期

5 陆玉英;提高野生山葡萄扦插成活率试验[J];广西农业科学;1996年04期

6 黄宏慧,彭宏祥,朱建华;都安县野生山葡萄酒原料生产现状与发展对策[J];广西农业科学;2003年02期

7 韦爽姿;覃文渊;覃韦茫;;文雅自然保护区野生山葡萄硬枝扦插生根实验初报[J];林业建设;2013年02期

8 熊影斯,彭宏祥,刘安阜,刘荣光;野生山葡萄插条催芽催根试验[J];广西农业科学;1997年02期

9 边为农;来信综合解答[J];新农业;2001年05期

10 ;[J];;年期

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 段薇;品牌是最终财富[N];中国质量报;2002年

2 陈宇　记者 王晶;三合林场走复合型经济发展之路[N];伊春日报;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 于冬冬;中国野生山葡萄VaERD15基因的功能验证[D];西北农林科技大学;2016年

2 刘楠;中国野生山葡萄抗寒基因cDNA文库构建及EST序列分析[D];西北农林科技大学;2011年

3 季梅;液—质联用检测虎仗和野生山葡萄中白藜芦醇及糖苷顺、反异构体研究[D];山东大学;2007年

，

本文编号：554012