条纹斑竹鲨肝脏中GSTP1基因的miRNA调控及其相互作用蛋白的研究

发布时间：2017-07-21 03:21

  本文关键词：条纹斑竹鲨肝脏中GSTP1基因的miRNA调控及其相互作用蛋白的研究

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【摘要】：肝脏再生是肝脏区别于其他脏器的显著特点,肝再生分子调控机理的研究也一直是肝脏研究领域的重点之一。目前,研究肝再生的模式生物一般为小鼠、大鼠或家兔,以海洋生物为研究对象的很少,对处于早期进化重要地位的软骨鱼类的研究未见报道。条纹斑竹鲨因其体积小、分布广、全年均可捕捞的特点常作为软骨鱼类的代表生物;同时条纹斑竹鲨肝脏约占内脏总体积的75%且具有免疫调节功能,所以我们选择以条纹斑竹鲨为模式生物进行肝再生的研究。本研究通过对条纹斑竹鲨正常肝脏转录组和损伤肝脏转录组进行差异表达分析获得359个差异表达基因(DEGs),其中包括142个下调基因,217个上调基因。然后通过差异基因GO富集分析、表达水平聚类分析和qRT-PCR验证,筛选出与肝再生相关且表达量显著差异的13个基因,其中10个基因(slc22a16,Slc39a4,Slc1a2,NR5A2,hoga1,ESR2,DIO1,Atp2a2,comp51558_c0,comp43528_c0)的表达量有明显上调,3个基因(GSTP1,comp44386_c0,comp60069_c3)的表达量明显下调,其中GSTP1基因是首次在条纹斑竹鲨肝脏转录组中发现的肝再生相关基因。为了进一步研究GSTP1基因的miRNA调控,本文运用miRanda和Target Scan生物信息学软件在条纹斑竹鲨小RNA文库中筛选出3个与GSTP1具有靶向性的miRNAs,分别是chp-let-7a、chp-miR-143-3p_R+1_1ss21CA和chp-miR-143。随后利用双荧光素酶报告基因检测系统进行验证,初步证明chp-miR-143与GSTP1具有靶向性,这为后续研究肝再生调控机理提供依据。本文通过构建原核表达载体pET-28a(+)-Shark GSTP1获得工程菌,经诱导表达得到重组蛋白His-Shark GSTP1,将纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。采取心脏取血的方式得到家兔全血,离心获得血清,并使用间接ELISA法测定效价,效价为1:51200。为降低血清中杂质的影响,我们采用蛋白A亲和层析的方法对兔血清进行纯化,并运用Western Blotting和MALDI-TOF MS在鲨鱼肝脏中首次验证了Shark GSTP1蛋白的存在。通过Co-IP方法从鲨鱼肝脏组织中的成功免疫沉淀出Shark GSTP1,并分离鉴定出与GSTP1互作的蛋白,大小约在70~100 kDa,为以后研究GSTP1与其他蛋白的相互作用、参与信号通路的调控等提供依据。
【关键词】：条纹斑竹鲨 肝再生 GSTP1 转录组 miRNAs
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q51
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-12
• 缩略语12-13
• 第一章 绪论13-16
• 1 条纹斑竹鲨的研究概况13
• 2 GSTP1的研究进展13-14
• 3 miRNA的研究进展14
• 4 转录组测序研究现状14-16
• 第二章 实验方案16-18
• 1 实验目的与意义16
• 2 实验内容16-17
• 3 实验流程图17-18
• 第三章 鲨鱼肝脏中GSTP1的发现及鉴定18-33
• 1 材料与试剂18-19
• 1.1 材料18
• 1.2 试剂18-19
• 2 方法19-26
• 2.1 鲨鱼的饲养19
• 2.2 鲨鱼肝脏 1/3 部分切除再生模型建立19-20
• 2.2.1 手术前准备19-20
• 2.2.2 肝脏 1/3 部分切除手术20
• 2.3 条纹斑竹鲨肝再生相关基因的筛选与GSTP1的发现20-26
• 2.3.1 转录组建库流程20
• 2.3.2 生物信息分析流程20-22
• 2.3.3 GO功能显著性富集分析22
• 2.3.4 富集性差异基因整合表达模式22-23
• 2.3.5 对筛选出的差异基因进行Real-Time PCR验证23-26
• 3 结果26-31
• 3.1 转录组测序数据质量预处理结果总览26
• 3.2 筛选出的差异基因26-28
• 3.3 差异基因的GO富集结果28-29
• 3.4 富集性差异基因整合表达模式分析结果29
• 3.5 总RNA提取结果29-30
• 3.6 qRT-PCR结果分析30-31
• 4 讨论31-33
• 第四章 筛选调控GSTP1基因表达的miRNA33-43
• 1 材料与试剂33
• 1.1 材料33
• 1.2 试剂33
• 2 方法33-38
• 2.1 Shark GSTP13’UTR的获得33
• 2.2 靶定miRNA的筛选33
• 2.3 3'UTR突变序列的引物设计33-34
• 2.4 3'UTR突变序列PCR扩增34-35
• 2.5 PCR产物割胶回收35
• 2.6 双酶切及连接反应35
• 2.7 连接产物的转化35
• 2.7.1 用CaCl_2法制备E. coli TG1、BL21（DE3）感受态细胞35
• 2.7.2 重组质粒的转化35
• 2.8 重组质粒的筛选和鉴定35-37
• 2.8.1 筛选阳性克隆35-36
• 2.8.2 质粒的小量制备36
• 2.8.3 菌液PCR鉴定36
• 2.8.4 双酶切鉴定36-37
• 2.8.5 重组质粒的测序鉴定37
• 2.9 筛选能靶定到GSTP1的miRNAs并合成minics37
• 2.10 质粒的提取37
• 2.11 细胞转染37-38
• 2.11.1 人肝癌Huh7细胞培养37
• 2.11.2 分别将质粒转染入Huh 7 细胞37-38
• 2.12 细胞裂解与荧光素酶报告基因检测38
• 3 实验结果38-41
• 3.1 筛选靶定到Shark GSTP13’UTR的miRNA38
• 3.2 3’UTR突变序列PCR扩增结果38-39
• 3.3 3’UTR及其突变序列重组质粒的鉴定39-40
• 3.4 质粒提取40
• 3.5 荧光信号值的处理40-41
• 4 讨论41-43
• 第五章 GSTP1多克隆抗体的制备43-57
• 1 条纹斑竹鲨GSTP1基因的原核表达及产物纯化43-49
• 1.1 材料与试剂43-46
• 1.1.1 材料43
• 1.1.2 试剂和仪器43
• 1.1.3 主要试剂的配置43-46
• 1.2 方法46-49
• 1.2.1 GSTP1基因的PCR扩增46-47
• 1.2.2 shark-GSTP1的抗原性分析47
• 1.2.3 重组质粒pET-28a(+)-GSTP1的构建47
• 1.2.4 连接产物的转化47-48
• 1.2.5 重组质粒的筛选和鉴定48
• 1.2.6 重组质粒在E. coli BL21中的诱导表达48
• 1.2.7 Shark GSTP1的纯化48
• 1.2.8 纯化抗原的检测（Western Blotting）48-49
• 2 重组Shark GSTP1多克隆抗体的制备49-51
• 2.1 材料与试剂49-50
• 2.1.1 材料与试剂49
• 2.1.2 主要试剂的配制49-50
• 2.2 方法50-51
• 2.2.1 抗原的制备50
• 2.2.2 免疫动物及多抗的制备50
• 2.2.3 血清多抗效价的测定（间接ELISA）50-51
• 2.2.4 抗体特异性的Western Blotting鉴定51
• 3 结果51-55
• 3.1 GSTP1的抗原表位分析51-52
• 3.2 重组表达载体pET-28a(+)-GSTP1的构建52-53
• 3.2.1 GSTP1的PCR扩增52
• 3.2.2 重组表达载体pET-28a(+)-GSTP1的鉴定52-53
• 3.2.3 重组表达载体pET-28a(+)-GSTP1的序列测定53
• 3.3 蛋白His- Shark GSTP1表达纯化的结果53-54
• 3.4 血清多抗效价检测54
• 3.5 血清多抗的Western Blotting分析54-55
• 4 讨论55-57
• 第六章 Shark GSTP1蛋白及其互作蛋白的鉴定57-63
• 1 试剂与仪器57
• 1.1 试剂57
• 1.2 仪器57
• 2 方法57-59
• 2.1 兔血清抗体的纯化57-58
• 2.2 质谱鉴定58
• 2.3 Shark GSTP1互作蛋白的研究（Co-IP）58-59
• 3 实验结果59-62
• 3.1 多抗的亲和纯化59-60
• 3.2 Co-IP的结果60-61
• 3.3 质谱分析结果61-62
• 4 讨论62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-69
• 致谢69

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